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>1. Biologische Probenvorbereitung
HINWEIS: Die gewählte anatomische Stelle und das Volumen der Blutentnahme liegen im Ermessen jedes einzelnen Untersuchers und haben keinen Einfluss auf das Ergebnis des Assays. Sobald sie entnommen wurden, sollten die Proben jedoch gemäß den unten aufgeführten Schritten gehandhabt werden.
- Vorbereitung von Serumproben
- Sammeln Sie das gewünschte Blutvolumen in das bevorzugte Entnahmeröhrchen und lassen Sie es mindestens 30 Minuten lang gerinnen.
- Zentrifugieren Sie die Probe 10 Minuten lang bei 1.000 x g bei Raumtemperatur.
- Das Serum entfernen und sofort testen oder in Mikrozentrifugenröhrchen aus Polypropylen aliquotieren und die Proben bei ≤ -20 °C lagern.
- Vorbereitung von Plasmaproben
- Sammeln Sie das gewünschte Blutvolumen mit mit Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) beschichteten Blutentnahmeröhrchen.
- Zentrifugieren Sie 10 Minuten lang bei 1.000 x g bei Raumtemperatur innerhalb von 30 Minuten nach der Entnahme.
- Entnehmen Sie das Plasma und testen Sie sofort oder aliquotieren Sie es in Mikrozentrifugenröhrchen aus Polypropylen und lagern Sie die Proben bei ≤ -20 °C.
- Vorbereitung von Gewebekultur-Überstandsproben
- Zentrifugieren Sie die Probe 10 Minuten lang bei 1.500 x g bei 4 °C, um Zellen und Ablagerungen zu entfernen.
- Überstand und Assay sofort auffangen oder in Mikrozentrifugenröhrchen aus Polypropylen aliquotieren und bei ≤ -20 °C lagern.
- Auftauen von gefrorenen biologischen Proben
- Zuvor gefrorene biologische Proben vor der Verwendung auf Eis und Vortex komplett auftauen und kurz vortexen. Vermeiden Sie mehr als 2 Gefrier-/Auftauzyklen.
Anmerkung: Die in diesem Protokoll verwendeten Proben wurden durch Kultivierung von BALB/c-Maus-Splenozyten (1 x 106 Zellen bei 37 °C + 5 % CO2 unter verschiedenen Bedingungen erhalten: unstimuliert, LPS (100 ng/ml), αCD3 (1 μg/ml, plattenbeschichtet) + αCD28 (1 μg/ml löslich), PMA (20 ng/ml) + Ionomycin (500 ng/ml). Die Kulturüberstände wurden nach 48 h entnommen und wie in Abschnitt 1.3 beschrieben verarbeitet.
>2. Vorbereitung des Reagenzes
- Herstellung von vorgemischten, mit Antikörpern immobilisierten Kügelchen
- Die Flasche der vorgemischten Kügelchen 1 Minute lang in einem Ultraschallbad bei Raumtemperatur beschallen und dann vor der Verwendung 30 s lang vortexen. Wenn kein Ultraschallbad verfügbar ist, erhöhen Sie die Wirbelzeit auf 1 min.
- Vorbereitung des Waschpuffers
- Bringen Sie den mit dem Kit gelieferten 20x Waschpuffer (20x PBS mit 1% Tween-20) auf Raumtemperatur und wirbeln Sie ihn ein, um alle Salze in die Lösung zu bringen.
- Verdünnen Sie 25 mL 20x Wash Buffer mit 475 mL deionisiertem Wasser. Lagern Sie unbenutzte Portionen zwischen 2 °C und 8 °C bis zu einem Monat.
- Vorbereitung von Matrix B (nur zur Verwendung mit Serum- und Plasmaproben)
- Geben Sie 5,0 ml des im Kit enthaltenen Assay-Puffers (PBS mit 1 % BSA) in die Flasche mit der lyophilisierten Matrix B. Lassen Sie mindestens 15 Minuten warten, bis die vollständige Rekonstitution erreicht ist, und mischen Sie sich dann gut mit dem Vortex. Übrig gebliebene rekonstituierte Matrix B kann bis zu einem Monat bei ≤ -70 °C gelagert werden.
>3. Standard-Vorbereitung
HINWEIS: Jeder Analyt in diesem Panel hat eine maximale Standardkonzentration von 10.000 pg/ml.
- Fügen Sie 250 μl Assay-Puffer hinzu, um den lyophilisierten Maus-Th-Zytokin-Standard-Cocktail zu rekonstituieren. Mixen Sie durch kurzes Vortexen und lassen Sie das Fläschchen 10 min bei Raumtemperatur ziehen.
- Füllen Sie den Standardcocktail in ein Mikrozentrifugenröhrchen aus Polypropylen mit der Aufschrift "C7". Dies wird als oberster Standard verwendet.
- Beschriften Sie 6 Mikrozentrifugenröhrchen aus Polypropylen mit C6, C5, C4, C3, C2 und C1.
- Geben Sie 75 μl Assay-Puffer in jedes dieser Röhrchen.
- 25 μl des Top-Standard-C7 in das C6-Röhrchen umfüllen und durch Vortexen gut mischen. Dies wird der C6-Standard sein.
- Führen Sie weiterhin serielle 1:4-Verdünnungen durch, indem Sie für jedes Röhrchen eine neue Pipettierspitze verwenden, um 25 μl des vorherigen Standards zu den 75 μl Assay-Puffer im nächstniedrigeren Standardröhrchen hinzuzufügen, gefolgt von einem Vortexen, um die Standards C5, C4, C3, C2 und C1 zu erhalten. Verwenden Sie Assay-Puffer als 0 pg/ml-Standard (C0).
>4. Verdünnung der Probe
HINWEIS: Vorläufige Pilotversuche mit diesem Assay mit mehreren Verdünnungen können erforderlich sein, um den am besten geeigneten Verdünnungsfaktor für einen bestimmten Satz biologischer Proben zu bestimmen. Ein geeigneter Verdünnungsfaktor führt zu Konzentrationsberechnungen für die Probe, die innerhalb der Grenzen der Standardkurve liegen. Die folgenden Schritte sind als Richtwerte gedacht und müssen je nach Probentyp ggf. empirisch ermittelt werden.
- Serum- oder Plasmaproben 2-fach mit Assay Buffer verdünnen (z.B. 50 μl Probe mit 50 μl Assay Puffer verdünnen) in Mikrozentrifugenröhrchen aus Polypropylen.
Anmerkung: Wenn eine weitere Probenverdünnung erforderlich ist, sollten die Verdünnungen mit Matrix B anstelle von Assay-Puffer durchgeführt werden, um eine genaue Messung zu gewährleisten. Die Zugabe von Serum- oder Plasmaproben ohne Verdünnung führt zu einer geringen Assay-Genauigkeit und kann die Filterplatte verstopfen. Matrix B besteht aus gepooltem Mausserum, das an endogenen Assay-Zielen erschöpft ist. Es wird als Serum- oder Plasmaprobenverdünnungsmittel verwendet, um Matrixeffekte zu vermeiden, von denen bekannt ist, dass sie die analytische Empfindlichkeit von Immunoassays beeinträchtigen.
- Zellkultur-Überstandsproben ohne Verdünnung testen.
Anmerkung: Die Analytgehalte können von Probe zu Probe stark variieren. Falls erforderlich, verdünnen Sie die Überstandsproben mit einem frischen Präparat des entsprechenden Zellkulturmediums oder Assay-Puffers.
>5. Assay-Verfahren
HINWEIS: Der Assay kann in Polypropylen-Filterplatten, Mikrofluoreszenz-aktivierten Zellsortierröhrchen (FACS) oder Mikrotiterplatten mit V-Boden durchgeführt werden. Das Filterplatten-Assay-Verfahren wird aufgrund der guten Konsistenz von Probe zu Probe, der Robustheit des Assays und der einfachen Handhabung empfohlen. Für dieses Verfahren ist eine Vakuumfiltrationseinheit zum Waschen erforderlich (die vom Endverbraucher zur Verfügung gestellt wird).
- Lassen Sie alle Reagenzien vor der Verwendung auf Raumtemperatur (20 - 25 °C) erwärmen.
- Setzen Sie die Filterplatte während der Assay-Einrichtung und der Inkubation immer auf eine umgekehrte Plattenabdeckung, so dass der Boden der Platte keine Oberflächen berührt, da dies zu Undichtigkeiten führen kann.
- Halten Sie die Platte während des gesamten Testvorgangs, einschließlich der Waschschritte, aufrecht, um den Verlust von Kügelchen zu vermeiden.
- Bewahren Sie die Platte für alle Inkubationsschritte im Dunkeln oder mit Alufolie umwickelt auf.
- Führen Sie alle Standards und Proben als Duplikate aus, die in sequenzieller Reihenfolge auf der Platte angeordnet sind.
- Befeuchten Sie die Filterplatte, indem Sie 100 μl 1x Waschpuffer in jede Vertiefung geben und 1 Minute lang bei Raumtemperatur ruhen lassen (bei Verwendung einer Mikroplatte mit Filterboden).
- Entfernen Sie das Puffervolumen mit dem Vakuumverteiler (5 - 10 s). Überschreiten Sie nicht 10 " Hg Vakuum. Tupfen Sie überschüssigen Waschpuffer vom Boden der Platte ab, indem Sie die Platte auf einen Stapel sauberer Papiertücher drücken. Legen Sie die Platte auf die umgedrehte Plattenabdeckung.
Anmerkung: Die Schritte 5.1 - 5.2 können entfallen, wenn der Assay mit einer Mikroplatte mit V-Boden oder Mikro-FACS-Röhrchen durchgeführt wird.
- Für Zellkulturüberstandsproben geben Sie 25 μl Assay-Puffer in alle Vertiefungen. Geben Sie 25 μl jedes Standards in die Standard-Wells. Geben Sie 25 μl jeder Probe in die Probenvertiefungen.
- Für die Messung von Serum- oder Plasmaproben geben Sie 25 μl Matrix B in die Standard-Wells. Geben Sie 25 μl Assay-Puffer in die Probenvertiefungen. Geben Sie 25 μl jedes Standards in die Standard-Wells. Geben Sie 25 μl jeder verdünnten Serum- oder Plasmaprobe in die Probenvertiefungen.
- Gemischte Kügelchen 30 s lang vortexen. 25 μl gemischte Kügelchen in jede Vertiefung geben und die Perlenflasche mit Unterbrechungen schütteln, um ein Absetzen der Perlen zu vermeiden. Das endgültige Volumen sollte in jeder Vertiefung nach der Zugabe von Kügelchen 75 μl betragen.
- Versiegeln Sie die Platte mit einem Plattenversiegeler. Wickeln Sie die gesamte Platte, einschließlich der umgedrehten Plattenabdeckung, mit Alufolie ein. Stellen Sie die Platte auf einen Plattenschüttler, befestigen Sie sie und schütteln Sie sie 2 Stunden lang bei Raumtemperatur bei ca. 500 U/min. Um ein Auslaufen zu verhindern, üben Sie keinen Überdruck auf das Plattenversiegelungsmittel aus.
- Legen Sie die Platte ohne Umdrehen auf den Vakuumverteiler, vakuumieren Sie wie zuvor und geben Sie 200 μl 1x Waschpuffer in jede Vertiefung
.
- Entfernen Sie den Inhalt der Vertiefungen der Assay-Platte durch Vakuumfiltration. Tupfen Sie überschüssigen Waschpuffer mit einem saugfähigen Pad oder Küchenpapier vom Boden der Platte ab. Wiederholen Sie diesen Schritt noch einmal.
Anmerkung: Wenn der Assay mit einer Mikroplatte mit V-Boden oder Mikro-FACS-Röhrchen durchgeführt wird, überspringen Sie die Schritte 1.12 und 1.13. Zentrifugieren Sie die Platte stattdessen 5 Minuten lang bei Raumtemperatur bei 1.000 x g und entfernen Sie dann den Überstand mit einer Mehrkanalpipette.
- Geben Sie 25 μl Nachweisantikörper (siehe Materialtabelle) in jede Vertiefung
.
- Verschließen Sie die Platte mit einem frischen Plattenversiegeler. Wickeln Sie die gesamte Platte, einschließlich der umgedrehten Plattenabdeckung, mit Alufolie ein.
- Stellen Sie die Platte auf einen Plattenschüttler und schütteln Sie sie 1 h lang bei ca. 500 U/min bei Raumtemperatur.
- Geben Sie ohne Vakuumieren 25 μl Streptavidin-Phycoerythrin (SA-PE)-Reagenz direkt in jede Vertiefung. Es ist keine Verdünnung des Reagenzes erforderlich.
- Verschließen Sie die Platte mit einem frischen Plattenversiegeler. Wickeln Sie die gesamte Platte, einschließlich der umgedrehten Plattenabdeckung, mit Alufolie ein.
- Stellen Sie die Platte auf einen Plattenschüttler und schütteln Sie sie 30 Minuten lang bei Raumtemperatur bei ca. 500 U/min.
- Wiederholen Sie Schritt 1.13 oben.
- Geben Sie 200 μl 1x Waschpuffer in jede Vertiefung. Die Perlen wieder für 1 Minute auf einem Plattenschüttler aufhängen.
- Übertragen Sie mit einer Mehrkanalpipette Proben von der Filterplatte in FACS-Röhrchen, um die Proben auf einem Durchflusszytometer abzulesen.
Anmerkung: Das Probenvolumen kann von 200 μl auf 300 μl erhöht werden, indem jedem Röhrchen zusätzliche 100 μl 1x Waschpuffer zugesetzt werden, um ein Trockenlaufen der Probe zu vermeiden. Falls erforderlich, können die Proben bei 4 °C gelagert, vor Licht geschützt und am nächsten Tag analysiert werden. Eine längere Lagerung der Probe kann jedoch zu einem verminderten Signal führen.