Durchflusszytometrie-basierte Analyse der Aktivierung dendritischer Zellen mit Hilfe von Immunkomplexen

Alle Verfahren, die die Probenentnahme beinhalten, wurden in Übereinstimmung mit den IRB-Richtlinien des Instituts durchgeführt.

>1. Isolierung von tumorassoziierten Monozyten-abgeleiteten dendritischen Zellen

1. Entfernen Sie in einer Laminar-Flow-Haube Tumore von CO₂ -euthanasierten Mäusen und platzieren Sie Tumore in RPMI-Medium ohne fötales Rinderserum (FBS).
   Anmerkung: Es wird dringend empfohlen, die Mäuse zu rasieren und mit 70%igem Ethanol zu besprühen, bevor die Tumore entfernt werden, um mögliche Kontaminationen durch das Fell zu minimieren. Achten Sie darauf, dass der Tumor 25 - 40 mm² nicht überschreitet, da größere Tumoren weniger dendritische Zellen (DC) haben, die dazu neigen, zerbrechlich und anfällig für den Zelltod zu sein. Wenn eine größere Anzahl von DC benötigt wird, können jeder Maus an mehreren Stellen Tumorzellen injiziert werden.
2. Unter einer sterilen laminaren Haube die Tumoren mit einer OP-Schere in kleine Stücke (ca. 1 x 1 mm²) schneiden.
   1. Geben Sie alle Tumorfragmente einer Maus in ein steriles 30-ml-Röhrchen mit flachem Boden mit magnetischen Rührstäbchen, die 5 mL Hank's Balanced Salt Solution (HBSS), 2 mg/ml Kollagenase IV und 0,01 mg/ml DNase I.
      Vorsicht: Myeloische Zellen produzieren Energie durch Glykosylierung, auch im stationären Zustand. Verwenden Sie daher nur Medien, die Glukose enthalten (z. B. HBSS, Roswell Park Memorial Institute (RPMI) und Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)), da ein Glukosemangel von nur 10 - 15 Minuten innerhalb von 24 Stunden zum Zelltod und zur Apoptose führt. Verwenden Sie nur eine Kollagenase mit niedrigem Endotoxingehalt IV, da Kollagenase von grampositiven Bakterien (Clostridium histolyticum) produziert wird.
3. Bei ca. 200 - 400 U/min in einem 37 ^°C Inkubator mit Magnetrührer für 20-30 min rühren.
4. Fügen Sie 5 ml des vollständigen Mediums hinzu und suspendieren Sie es kräftig.
5. Filtern Sie die Zellen durch ein 70-μm-Zellsieb. Zentrifugieren Sie bei 4 ^°C 400 rcf für 5 - 10 min, um die Zellen zu pelletieren.
   Vorsicht: Versuchen Sie nicht, die Zellen direkt nach der enzymatischen Verdauung zu isolieren, da einige Tumoren nekrotisch sind und relativ große Mengen an Zelltrümmern oder extrazellulärer Matrix enthalten. Tragen Sie die Zellen auf ein Medium mit einem Dichtegradienten von 15 % auf, um nur die Zellen zu erhalten.
6. Suspendieren Sie 9 mL Dichtegradientenmedium mit 1 mL 10x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), um die Osmolalität einzustellen und 100%ige Percoll-Stammlösung zu erhalten. Mischen Sie 1,5 mL Density Gradient Medium Stammlösung mit 8,5 mL HBSS und mischen Sie es kräftig mit Tumorzellpellets. Schichten Sie vorsichtig 2 mL DMEM auf ein Medium mit einem Dichtegradienten von 15 % und zentrifugieren Sie 20 Minuten lang bei Raumtemperatur bei 400 rcf. Entsorgen Sie die Überstände, da die Zellen am Boden des Röhrchens ein Pellet bilden.
   1. Waschen Sie die pelletierten Zellen zweimal, indem Sie sie in 10 ml HBSS mit 2 % FBS, 1 % Penicillin/Streptomycin und 10 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) (Isolationspuffer) erneut suspendieren und 5-10 Minuten lang bei 4 ^°C 400 rcf zentrifugieren, um die Zellen zu pelletieren.
   2. Zählen Sie die Zellen auf einem Hämozytometer mit Trypanblau unter einem Lichtmikroskop.
7. 1 x 10⁸ Zellen in 1 ml Isolationspuffer resuspendieren und bei 4 ^°C mit 30 μl CD11b⁺ konjugierten magnetischen Kügelchen für 15 Min. inkubieren
   ACHTUNG: Vermeiden Sie die Verwendung von CD11c-konjugierten Kügelchen, da dies das DC aktiviert und den Zelltod induziert. Versuchen Sie nicht, FcγRII und FcγRIII mit Anti-CD16/32-Antikörpern zu blockieren. Blockierende Antikörper ligieren FcγR, induzieren eine starke Phosphorylierung von Mitogen-aktivierten Protein (MAP)-Kinasen und primen das DC.
   1. Entfernen Sie die überschüssigen ungebundenen Kügelchen, indem Sie 9 mL Isolationspuffer hinzufügen und die Zellen bei 400 rcf für 5 - 10 min bei 4^°C zentrifugieren.
8. Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml Isolationspuffer. Tragen Sie die Zellen auf eine vorgewaschene magnetische Säule auf. Waschen Sie die Säule zweimal mit 3 mL Isolationspuffer.
   1. Entfernen Sie die Säule vom Magneten. Pipettieren Sie 6 ml Isolationspuffer auf die Säule und spülen Sie die magnetisch markierten Zellen durch Drücken des Kolbens in ein steriles Sammelröhrchen aus. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 400 rcf für 5 - 10 min bei 4 ^°C.
   2. Zellen bei 100 μl pro 1 x 10⁷ Zellen resuspendieren und mit den folgenden Fluorophor-konjugierten Antikörpern färben: Linage negativ (TCRb, Siglec F, B220, CD19, FceRI und Ly6G), MHCII, Ly-6C.
9. Sortieren Sie die Zellen durch Gating der kleinen Zellen mit Seitenstreuung (SSC) und Vorwärtsstreuung (FSC) und kultivieren Sie sie in einem vollständigen Medium, das mit 5 ng/mL GM-CSF ergänzt wird. Inkubieren Sie die Zellen 1 Stunde lang bei 37 ^°C, damit die Makrophagen an der Platte haften können. Übertragen Sie dann die losen und nicht anhaftenden Zellen in eine neue Kulturschale.
   Anmerkung: Maus-MoDC sind definiert als CD11b⁺/CD11c⁺/MHCII^hi/Ly6C^lo/int. Die Expression von Ly6C kann zwischen den Tumormodellen dramatisch variieren, und in einigen Modellen (z. B. LMP) fehlt bei MoDCs die Ly6C-Expression vollständig. Ein 100 mm³ B16F10 Tumor enthält typischerweise 5 x 10⁴ DC, was zu insgesamt etwa 4 - 5 x 10⁶ Zellen führt. Von diesen Zellen sind 10 - 15% Immunzellen und 8 - 10% MoDC. Eine Erhöhung der DC-Zahlen kann erreicht werden, indem Mäusen Tumore an mehreren Stellen injiziert werden. Sortieren Sie nur kleine SSC/FCS-Zellen, da andere myeloische Zellen Marker wie CD11c und Ly6C exprimieren können.
   wahlfrei: Sortieren Sie die tumorinfiltrierenden Monozyten als kleine SSC/FSC-Zellen, die Ly6C^hi exprimieren und negativ für MHCII sind. Anschließend werden Monozyten in vitro mit 50 ng/mL GM-CSF kultiviert, um DC zu erhalten.

>2. Herstellung von Tumor-IgG-Immunkomplexen

1. Kultivierung von Tumorzellen in einem 75 cm² Kulturkolben mit 70 % Konfluenz in vollständigen DMEM-Medien.
   1. Fügen Sie 2 ml 0,25 % Trypsin/EDTA hinzu, um die Zellen aus dem Kulturkolben zu lösen, und überwachen Sie die Zellmorphologie unter einem Lichtmikroskop, um eine übermäßige Trypsinisierung zu vermeiden.
   2. Geben Sie 8 ml vollständiges Nährmedium (pro 2 ml Trypsin) hinzu, um den Trypsinverdau zu hemmen, und zentrifugieren Sie es 5-10 Minuten lang bei 4 ^°C, 400 rcf, um die Zellen zu pelletieren.
      Anmerkung: Überprüfen Sie Tumorzellen mit einem kommerziellen PCR-Kit auf Mykoplasmen. Test auf gramnegative Bakterien und Pilzendotoxine mit Limulus-Amöbozyten-Lysat (LAL)-Assay). Das Serum muss durch 0,22 μM filtriert und auf die Viren des 9. Code of Federal Regulations getestet werden. Testen Sie zusätzlich die Nährmedien und Seren, indem Sie 100 - 200 μl auf LB-Agar oder Bouillon geben und 2 Tage lang bei 37 ^°C kultivieren.
   3. Waschen Sie die Zellen erneut von Trypsin und Serumresten, indem Sie sie in 10 mL PBS resuspendieren und bei 400 rcf für 5 - 10 min zentrifugieren. Aspirieren Sie den Überstand und wiederholen Sie die Wäsche noch 2 Mal.
2. Fixieren Sie die Zellen 10 Minuten lang bei Raumtemperatur in 1,8 % gepuffertem Paraformaldehyd.
   1. Waschen Sie die Zellen, indem Sie sie in 10 mL PBS resuspendieren und bei 4 ^°C 400 rcf für 5 - 10 min zentrifugieren.
   2. Überstände absaugen und die Wäsche noch zwei Mal wiederholen.
      wahlfrei: Für Tumoraufnahme-Assays können Zellen markiert werden, indem sie 5 Minuten lang bei 37 ^°C in PBS mit 1 μM Carboxyfluorescein-Succinimidylester (CFSE) inkubiert werden. CFSE wird dann 10 Minuten lang mit vollständigem Medium in Eis abgeschreckt. Die Zellen sollten ausgiebig in PBS mit 2% Serum gewaschen werden, um Farbstoffreste zu entfernen.
3. Resuspendieren Sie Zellen in Fluoreszenz-aktiviertem Zellsortierpuffer (FACS) (PBS, ergänzt mit 2 % FCS + 5 mM EDTA) und 0,5 μg/ml Anti-CD16/32, um potenzielle unspezifische Protein-Protein-Wechselwirkungen zu blockieren. Platte in U-Form 96 Wells/Platte mit einer Konzentration von 1 x 10⁵ Zellen pro 100 μL.
   1. Fügen Sie verschiedene Verdünnungen von tumorbindenden Antikörpern im Bereich von 5 μg - 5 ng/1 x 10⁵ Zellen hinzu. Den Teller 15-20 Min. auf Eis inkubieren lassen
      Anmerkung: IgG-Antikörper wurden, wie beschrieben, aus dem Serum naiver 20-24 Wochen alter weiblicher Mäuse auf Protein-A-Säulen isoliert.
4. Waschen Sie die Zellen durch Zugabe von 150 μl PBS und zentrifugieren Sie die Platte bei 4 ^°C 400 rcf für 5 - 10 min.
   1. Entsorgen Sie die Überstände und wiederholen Sie die Wäsche zweimal. Resuspendieren Sie die Zellen in einem 100 μl FACS-Puffer, der Fluorophor-konjugierte Sekundärantikörper enthält. Platte 20 min auf Eis inkubieren.
   2. Waschen Sie die Zellen durch Zugabe von 200 μl FACS-Puffer und zentrifugieren Sie die Platte bei 400 rcf für 5 - 10 min. Entsorgen Sie die Überstände und wiederholen Sie den Waschvorgang.
   3. Analysieren Sie die Tumorbindung mittels Durchflusszytometrie und bestimmen Sie die minimale Konzentration, die erforderlich ist, um die Zellen zu beschichten.
      Anmerkung: Antikörper, die die mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) gefärbter Tumorzellen gegenüber der Isotypkontrolle nicht um mindestens das Fünffache erhöhen, sollten in nachfolgenden funktionellen Assays nicht verwendet werden.

>3. Aktivierung von MoDC mit Tumor-IgG IC

1. Beschichten Sie Tumorzellen mit minimaler IgG-Konzentration, wie in den Abschnitten 2.1 bis 2.4.3 beschrieben
   1. Einen Tag vor der Aktivierung von MoDC mit Tumor-IC ist der Austausch von MoDC-Kulturmedien, die GM-CSF enthalten, zu ersetzen. Saugen Sie dazu das Medium vorsichtig an und waschen Sie die Zellen einmal mit vorgewärmtem Komplettkulturmedium.
      Anmerkung: Isolierte reife tumorassoziierte MoDC sollten nach der Sortierung in vollständigen Medien ohne GM-CSF und vor der Aktivierung mit IC mindestens 2 - 3 h (oder sogar über Nacht) kultiviert werden.
   2. Für Tumoraufnahmeanalysen fügen Sie das CFSE-markierte Tumor-IC in einem Verhältnis von 1:5 (IC: MoDC) zu MoDC hinzu und inkubieren Sie es über Nacht für 12 - 16 h in 1 mL vollständigem Medium pro 1 x 10⁶ DC.
   3. Für FACS-Analysen von MoDC-Aktivierungsexperimenten fügen Sie Tumor-IC im Verhältnis 1:1 (IC: MoDC) hinzu und inkubieren über Nacht für 12 - 16 h.
      Anmerkung: Es wird dringend empfohlen, eine positive Kontrollvertiefung einzuschließen, in der MoDC mit 1 μg/mL LPS oder anderen TLR-Agonisten stimuliert werden.
   4. Nach der Aktivierung über Nacht aspirieren Sie die Überstände und waschen die Zellen vorsichtig dreimal vorsichtig mit Isolationspuffer oder 10 mM EDTA HBSS.
   5. Um DC von der Platte zu lösen, inkubieren Sie die Zellen 2 - 3 Minuten lang in 1 ml HBSS mit 10 mM EDTA und lösen Sie die Zellen durch kräftiges Pipettieren.
   6. Zellen bei 400 rcf zentrifugieren und 1 x 10⁶ DC in 90 μl PBS re-suspendieren, ergänzt mit 2 % FCS, 5 mM EDTA (FACS-Puffer) und 0,5 μg blockierenden Antikörpern. 5 - 10 Min. auf Eis inkubieren.
   7. Geben Sie 10 μl der Färbeantikörpermischung in die Zellen und inkubieren Sie sie 15 Minuten lang auf Eis.
   8. Geben Sie 2 mL FACS-Puffer in die Zellen und zentrifugieren Sie sie 5 - 10 Minuten lang bei 4 ^°C 400 rcf.
2. Resuspendieren Sie die Zellen in 200 μl FACS-Puffer.
   1. Fügen Sie 1 - 2 Minuten vor der Durchführung der Proben 0,5 - 1 μg/ml DAPI hinzu, um tote Zellen von der Analyse auszuschließen. Inkubieren Sie DAPI nicht zu lange, da MoDC es innerhalb von 10 - 15 Minuten aufnimmt.