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>1. Gewebeschnitt und Objektträgervorbereitung
- Schneiden Sie Schnitte von formalinfixierten, paraffineingebetteten (FFPE) Geweben mit einer Dicke von 3-5 μm mit einem Mikrotom.
- Schwimmen Sie die Abschnitte auf gereinigtes Wasser mit einer Temperatur von ca. 10 °C unter dem Schmelzpunkt des verwendeten Paraffins. Heben Sie die Schnitte aus dem Wasser auf speziell behandelte Objektträger (siehe Materialtabelle). Lassen Sie das Wasser gründlich von den Rutschen ablaufen.
- Inkubieren Sie die Objektträger über Nacht bei 50 °C, um die Haftung des Objektträgers des Gewebes zu verbessern.
Anmerkung: Es ist vorzuziehen, frisch geschnittene Gewebe für IHC-Protokolle vorzubereiten, obwohl TSE-Positiv- und Negativkontrollschnitte im Voraus vorbereitet und gelagert werden können. Die Schritte 2 bis 4 müssen in einem chemischen Abzug durchgeführt werden.
>2. Entparaffinisierung und Rehydrierung
- Legen Sie die Objektträger mit den Gewebeschnitten in einen Färbekorb aus Edelstahl (siehe Materialtabelle). Tauchen Sie den Korb für 3 min in ein Xylolbad (Beizbehälter aus Edelstahl), nehmen Sie ihn heraus und tauchen Sie ihn erneut ein.
- Entfernen Sie das Xylol und die Rehydratabschnitte, indem Sie sie 3 Minuten lang in ein absolutes Ethanolbad tauchen. Entfernen Sie sie und tauchen Sie sie erneut ein.
- Trocknen Sie die Abschnitte an der Luft und legen Sie sie 1 Minute lang in ein 90%iges Ethanolbad. Übertragen Sie sie für eine weitere Minute in ein 70%iges Ethanolbad, gefolgt von einer abschließenden Übergabe in ein 50%iges Ethanolbad für 1 Minute. Rühren Sie den Schieberkorb bei jeder Ethanolbadbehandlung zweimal vorsichtig und entleeren Sie den Korb vor dem nächsten Transfer.
>3. Abrufen von Epitopen
- Tauchen Sie die Gewebeschnitte vorsichtig 30 min lang bei Raumtemperatur in 98%ige Ameisensäure. Spülen Sie die Schnitte 5 min lang mit Leitungswasser ab und spülen Sie sie anschließend zweimal mit destilliertem Wasser ab.
Vorsicht: Ameisensäure ist stark korrosiv. Es muss eine Schutzbrille und Handschuhe getragen werden.
- Führen Sie die hitzeinduzierte Antigen-Entnahme (HIER) durch, indem Sie die folgenden Schritte ausführen.
Anmerkung: Dieser Schritt wird durch hydratisiertes Autoklavieren bei 121 °C für 30 min in einer speziellen Druckkammer durchgeführt (siehe Materialtabelle).
- Den Citratpuffer (10 mM, pH 6,1, siehe Materialtabelle) auf 98 °C für ca. 20 min in einem mit 500 mL destilliertem Wasser gefüllten Beizbehälter aus Edelstahl in der Druckkammer vorheizen.
Anmerkung: Für die vorliegende Studie betrug das Programm Sollwert 1 (SP1) für die spezifisch verwendeten Geräte.
- Nachdem der Alarm anzeigt, dass das Gerät die programmierte Zeit und Temperatur erreicht hat, tauchen Sie den Korb mit Rutschen ein und starten Sie das Programm auf Sollwert 2 (121° C für 30 Minuten). Legen Sie zu Qualitätskontrollzwecken ein Stück selbstklebendes Autoklav-Anzeigeband auf den Korb, um die Temperatur und den Druck zu überwachen, und zeichnen Sie den Anfangs- und Enddruck dieses Programms auf.
- Wenn die Anzahl der zu immunfärbenden Objektträger die Kapazität des Korbs nicht erreicht, verwenden Sie saubere, leere Objektträger, um leere Positionen zu besetzen. Lassen Sie die Kammer nach Beendigung des Programms passiv auf den Umgebungsdruck zurückführen (mindestens 30 min).
Anmerkung: Längere Zeiträume können unspezifische Hintergrundfärbungen reduzieren.
- Schieben Sie den Objektträgerkorb vorsichtig für 5 Minuten in einen mit destilliertem Wasser gefüllten Beizbehälter aus Edelstahl.
>4. Inaktivierung der endogenen Peroxidase
- Der Objektträgerkorb mit den Probenschnitten wird 30 min lang in ein Bad mit 3 % Wasserstoffperoxid (H2O2) in Methanol getaucht. Die Schnitte werden unter fließendem Wasser (5 min) abgespült. Die Abschnitte abtropfen lassen und für weitere 5 min in 1x Tris-gepufferte Kochsalzlösung (TBS) tauchen.
>5. Immunnachweis
HINWEIS: Für die vorliegende Studie wurde die Immundetektion unter Verwendung des Kapillarlückenformats unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Slide-Clip-Montagesystems durchgeführt (siehe Materialtabelle). Andere immunhistochemische Objektträgersysteme sind ebenfalls anwendbar.
- Legen Sie jeden Objektträger auf einen handelsüblichen Abdeckplattenhalter (siehe Materialtabelle), der mit TBS vorbefeuchtet ist, wobei Blasen vermieden werden, wobei die Gewebeseite zum Halter zeigt und die Objektträgerkanten mit den beiden unteren Punkten des Halters übereinstimmen.
- Halten Sie die Objektträgerhalter-Einheit zwischen Daumen und Zeigefinger, wobei ein Finger auf dem Objektträger und der andere auf der Unterseite des Halters liegt. Platzieren Sie dann die Assembly in der Galerie des Systems.
- Um sicherzustellen, dass das Set gut zusammengebaut ist, füllen Sie die Vertiefung zwischen dem Objektträger und dem Halter mit TBS, das nicht sofort überlaufen darf. Achten Sie ab diesem Zeitpunkt darauf, dass ca. 80 μl TBS zwischen dem Halter und dem Objektträger zurückgehalten werden müssen. Lassen Sie die Abschnitte nicht trocknen.
- Um die Hintergrundfärbung vor der Behandlung mit Primärantikörpern (Antikörper gegen Prionproteine (Anti-PrP)) zu verringern, inkubieren Sie die Probenträger im System mit 20 % normalem Serum von derselben Spezies wie der sekundäre Antikörperwirt, der für die Immunfärbung verwendet wird (im vorliegenden Fall Pferdeserum), für 30 Minuten bei TBS vor.
- Die Anzahl der zu verwendenden Antikörperaliquote entsprechend der zu analysierenden Tierart, die Anzahl der zu untersuchenden Probenabschnitte und die Menge der Arbeitsverdünnung wird aufgetaut.
Anmerkung: Um beste Ergebnisse zu erzielen, verwenden Sie 10 % normales Serum von derselben Spezies wie die Quelle des Sekundärantikörpers und der Primärantikörperlösungen. Wenn möglich, sollte die Wirtsquelle des normalen Serums und des Sekundärantikörpers von derselben Spezies stammen, um optimale Ergebnisse zu erzielen.
- Ohne die Schnitte zu waschen, tragen Sie die Primärantikörperlösung (200 μl) direkt in jede Vertiefung des Objektträgerhalter-Sets auf und inkubieren Sie sie 60 Minuten lang bei Raumtemperatur.
- Füllen Sie zum Waschen die Vertiefungen der Objektträger-Sets mit TBS und warten Sie 5 Minuten. Wiederholen Sie den Vorgang zweimal.
- Der biotinylierte Sekundärantikörper (monoklonales anti-murines Horse Ab, siehe Materialtabelle) wird bei 1/200 in TBS mit 10 % Pferdeserum verdünnt. Bereiten Sie das erforderliche Volumen in Abhängigkeit von der Anzahl der zu behandelnden Abschnitte vor.
- Tragen Sie die Sekundärantikörperlösung (200 μl) auf jede Vertiefung des Objektträgerhalter-Sets auf. 30 min bei Raumtemperatur inkubieren.
- Waschen Sie wie in Schritt 5.5 beschrieben.
- Für die Inkubation mit Avidin-Biotin-Komplex-Peroxidase (ABC/HRP-Komplex, siehe Materialtabelle) bereiten Sie das Reagenz 30 Minuten vor der Verwendung vor. Tragen Sie die ABC/HRP-Komplexlösung (200 μl) in jede Vertiefung des Gleitplattenhalter-Sets auf. 30 min bei Raumtemperatur inkubieren.
- Waschen Sie wie in Schritt 5.5 beschrieben.
>6. Entwicklung mit 3,3' Diaminobenzidin (DAB) Chromogen
VORSICHT: DAB ist ein potentielles Karzinogen. Daher ist bei der Arbeit mit diesem Reagenz eine angemessene Sorgfalt erforderlich, einschließlich Augenschutz, Laborkittel, Handschuhe und gute Laborverfahren. Entsorgen Sie die folgenden örtlichen Vorschriften.
- Verdünnen Sie das Chromogen unmittelbar vor Gebrauch gemäß den Anweisungen des Herstellers (siehe Materialtabelle). Tragen Sie die Chromogenlösung (400 μl) auf jede Vertiefung des Gleitplatten-Sets auf.
Bis - zu 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. In PrPSc (abnormale Isoform von Prionproteinen) positiven Schnitten ist in der Regel eine Inkubationszeit von 10 Minuten ausreichend.
- Entfernen Sie die restliche Chromogenlösung, indem Sie die Objektträger in destilliertem Wasser waschen. Nehmen Sie die Dias aus den Abdeckplattenhaltern und legen Sie sie in einen Plastikbehälter mit destilliertem Wasser.