Eine Technik zum Nachweis cyanobakterieller Stämme mit Hilfe eines Antikörper-Microarray-Chips

Zusammenfassung

Quelle: Blanco, Y. et al., Experimentelles Protokoll zum Nachweis von Cyanobakterien in flüssigen und festen Proben mit einem Antikörper-Microarray-Chip.J. Vis. Exp. (2017)

Dieses Video zeigt eine Methode zum Nachweis der Cyanobakterienstämme in einer Umweltprobe mit einem Antikörper-Microarray-Chip. Proben, die verschiedene Bakterien tragen, interagieren mit gedruckten Antikörpern, und die Immunfärbung mit Fluorophor-markierten Anti-Cyanobakterien-Stamm-Antikörpern zeigt das Vorhandensein spezifischer Cyanobakterienstämme durch Fluoreszenz an bestimmten Stellen.

Protokoll

>1. Vorbereitung der Immunogene

1. Jeder Cyanobakterienstamm wird im entsprechenden Nährmedium unter den in Tabelle 1 beschriebenen Bedingungen gezüchtet.
   HINWEIS: Das Wachstumsmedium und die Kulturbedingungen für jeden Cyanobakterienstamm sind in Tabelle 1 aufgeführt. Alle Cyanobakterienstämme, mit Ausnahme von K17, gehören zur Gruppe von Antonio Quesada von der Autonoma University (Madrid, Spanien). Der Antikörper gegen Planktothrix rubescens wurde aus einer natürlichen Probe der monospezifischen Blüte dieses Cyanobakteriums aus dem Vilasouto Reservoir (Nordspanien) gewonnen.
2. Quantifizieren Sie die Anzahl der Zellen unter Verwendung einer Zellzählkammer durch optische Mikroskopie, um etwa 10⁸ Zellen/ml aus einer Kultur der späten exponentiellen oder stationären Wachstumsphase zu erhalten.
3. Ernten Sie Zellen aus 5 mL Kultur durch Zentrifugation bei 2.000 x g für 5 min.
4. Der Überstand wird verworfen und die Zellen werden in einem 10-ml-Röhrchen mit 5 ml 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (1x PBS) resuspendiert, um etwa 10⁸ Zellen/ml zu erhalten.
5. Homogenisieren und lysieren Sie die Zellen der Suspension durch Beschallung für 5 Zyklen zu je 30 s mit einer Pause von 30 bis 60 s auf Eis, mit einem tragbaren, tragbaren Ultraschallprozessor oder durch Eintauchen des Rohrs in das Wasserbad eines Zelldisruptors bei maximaler Amplitude (30 kHz).
6. Die Schritte 1.3 - 1.5 für jeden Cyanobakteriumstamm wiederholen.
   HINWEIS: Die Beschallung führt zu Zellaufschluss und Freisetzung von zellulären Inhalten. Während Proteine und Polysaccharide gute Immunogene sind, induzieren spezifische Moleküle wie Lipide und Nukleinsäuren von sich aus keine humorale immunogene Reaktion. Daher müssen sie an Träger, wie Polysaccharide oder Proteine, binden, um die molekulare Komplexität zu erhöhen. Darüber hinaus wird durch die Beschallung intrazelluläres Material freigesetzt, das die Antikörperproduktion auslösen kann.

>2. Herstellung von polyklonalen Antikörpern

1. Bereiten Sie die erste Immunogendosis vor, indem Sie 0,5 ml des in Schritt 1,5 erhaltenen ultraschallisierten Zelllysats mit 0,5 ml vollständigem Freund-Adjuvans mischen. Liefern Sie es an den Betreiber einer Tieranlage zur Herstellung von polyklonalen Kaninchen-Antikörpern.
2. Bereiten Sie drei weitere Dosen wie zuvor für die weitere Verwendung als Gedächtnisverstärker im Antikörperherstellungsprozess vor, indem Sie 0,5 ml desselben Homogenats/Lysats, das Sie in Schritt 1.5 erhalten haben, mit 0,5 ml unvollständigem Freund-Adjuvans mischen. Geben Sie sie der Tiereinrichtung, um den Antikörperproduktionsprozess durchzuführen.
3. Die Schritte 2.1 und 2.2 werden für jeden neuen Prozess zur Herstellung von Antikörpern wiederholt.
   HINWEIS: Normalerweise wird die Antikörperproduktion spezialisierten Tiereinrichtungen oder -unternehmen anvertraut, da für die Arbeit mit Tieren eine entsprechende Lizenzierung und Schulung erforderlich ist. Die Unternehmen liefern einen relativen Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA), der die Menge der in der Serumprobe vorhandenen antigenspezifischen Antikörper
misst.

>3. Aufreinigung von Antikörpern

1. Reinigen Sie die Immunglobulin-G-Fraktion (IgG) sowohl aus dem Immun- als auch aus dem Präimmunserum, das in Schritt 2 durch Protein-A-Affinitätschromatographie entnommen wurde. Einige kommerzielle Reinigungskits, die auf Kartuschensystemen basieren, funktionieren gut; Befolgen Sie die Anweisungen des Anbieters.
2. Wenn das Aufreinigungskit kein Entsalzungssystem bietet, ändern Sie den Puffer nach der Elution der gereinigten Antikörper auf 0,1x PBS, entweder durch Dialyse oder durch Verwendung von Zentrifugalfiltergeräten mit einer Membranporengröße von 100 kDa (oder weniger).
3. Bestimmen Sie die Antikörperkonzentration durch Messung der Extinktion bei 280 nm oder mit kolorimetrischen Methoden wie Bradford, Lowry oder Bicinchoninsäure (BCA).
   HINWEIS: Es ist wichtig, die Aufnahme von Amingruppen in den Elutionspuffer (z. B. Tris-Puffer) zu vermeiden, da sie mit dem Antikörper um die Bindung an feste Oberflächen, die mit Epoxidgruppen aktiviert sind, konkurrieren. Nach der Aufreinigung ist es wichtig, die Antikörperaktivität mit ELISA zu testen.

>4. Markierung von Fluoreszenz-Antikörpern

1. Die in Abschnitt 3 erhaltenen gereinigten Antikörper werden mit einem Fluorochrom (z. B. einem dunkelroten Fluoreszenzfarbstoff) markiert, indem ein handelsübliches Fläschchen mit Farbstoff zur Markierung von 1 mg Protein in 100 μl Dimethylsulfoxid (DMSO) aufgelöst wird. 2 μl des gelösten Farbstoffs werden zu jedem Antikörperpräparat in einer Konzentration von 2 mg/ml in einem Endvolumen von 50 μl in 50 mM phosphatgepufferter Kochsalzlösung (pH 8,5) gegeben.
2. Halten Sie die Markierungsreaktionen unter kontinuierlichem Rühren für 1 h bei Umgebungstemperatur und 1.200 U/min auf einer vibrierenden Plattform aufrecht.
3. Aufreinigung der markierten Antikörper durch Größenausschlusschromatographie (z. B. unter Verwendung eines Gels mit einem Fraktionierungsbereich zwischen 1,5 und 30 kDa, das in einer Säule gefangen ist), gemäß den Empfehlungen des Lieferanten.
4. Messen Sie die Extinktion bei 280 nm und bei 650 nm in Eluaten und berechnen Sie die Kennzeichnungseffizienzen gemäß den Empfehlungen des Lieferanten.
   HINWEIS: Bis zu 50 x 50 μl Antikörpermarkierungsreaktionen können mit einem einzigen Fläschchen des Fluoreszenzfarbstoffs zur Markierung von 1 mg Protein durchgeführt werden. Es wird empfohlen, die Röhrchen mit Aluminiumfolie abzudecken oder alternativ undurchsichtige 0,5-ml-Röhrchen zu verwenden, um Abschreckprozesse nach Schritt 4.3 zu vermeiden. Bei IgG-Antikörpern wird eine optimale Markierung mit 3-7 mol des Farbstoffs pro mol Antikörper erreicht.

>5. CYANOCHIP-Produktion

1. Antikörper und Kontrollen in Drucklösung
   1. Bereiten Sie 30 μl jedes gereinigten Antikörpers in Drucklösung vor, indem Sie jeden Antikörper mit 1 mg/ml in einem handelsüblichen 1x Proteindruckpuffer mit 0,01 % (v/v) Tween 20 (einem nichtionischen Detergens) mischen, alles als Endkonzentrationen.
      HINWEIS: Alternativ kann eine Antikörperlösung 20 % Glycerin, 1 % (w/v) Saccharose (oder Trehalose, als Konservierungsmittel) und 0,01 % (v/v) Tween 20 in Karbonatpuffer (pH 8,5) enthalten.
   2. Bereiten Sie 30 μl der Drucklösung als Kontrollen vor: (a) 1x Proteindruckpuffer mit 0,01 % (v/v) Tween 20, (b) Protein-A-gereinigtes Präimmunserum mit 1 mg/ml in 1x Proteindruckpuffer mit 0,01 % (v/v) Tween 20 und (c) Rinderserumalbumin (BSA) mit 1 mg/ml in 1x Proteindruckpuffer mit 0,01 % (v/v) Tween 20.
   3. Bereiten Sie 30 μl eines fluoreszenzmarkierten, gereinigten Präimmunserums in verschiedenen Konzentrationen (z. B. von 50 μg/ml bis 1 μg/ml) in 1x Proteindruckpuffer mit Tween 20 her, wie in Schritt 5.1.1. Diese Proben werden als Fluoreszenzrahmenmarker und zur relativen Fluoreszenzquantifizierung nach der Schmierblutung verwendet.
   4. Geben Sie 30 μl der in den Schritten 5.1.1, 5.1.2 und 5.1.3 hergestellten Drucklösungen pro Vertiefung zu den hochwertigsten 384-Well-Mikroplatten für die Microarray-Herstellung, wie z. B. Polypropylen.
      HINWEIS: Proteindruckpuffer erhöht die Qualität und Stabilität der Antikörper, und Tween 20 homogenisiert die Spot-Morphologie und baut die Proteinkopplung auf. Es wird empfohlen, die 384-Well-Mikroplatte vor der Verwendung bei 4 °C zu halten. Lagern Sie es über einen längeren Zeitraum bei -20 °C. Polypropylen hat eine geringe DNA-, Protein-, Zellextrakt- und kleinmolekulare intrinsische Bindung.
2. Drucken von Antikörpern auf einen Objektträger
   HINWEIS: Drucken Sie die Antikörper auf aktivierte Objektträger, indem Sie verschiedene Array-Plattformen verwenden, z. B. Kontakt-, Split-Needle- oder berührungslose Geräte wie piezoelektrische Drucker oder "Tintenstrahl"-Technologien. In dieser Arbeit wurde der CYANOCHIP routinemäßig durch Kontakt mit einem robotischen System (Arrayer) gedruckt, das in der Lage ist, nL-Mengen der Antikörper auf der μm-Skala zu erkennen.
   1. Stellen Sie die Umgebungsbedingungen des Drucksaals auf 20 °C und 40 - 50 % relative Luftfeuchtigkeit ein.
   2. Richten Sie die Objektträgersubstrate (z. B. 75 x 25 mm epoxidaktivierte Objektträger) so ein, dass auf jedem Objektträger mehrere identische Antikörperarrays erstellt werden.
   3. Jeder gereinigte Antikörper, einschließlich der Kontrollen und des Referenzrahmens, wird in einem dreifachen Spot-Muster aufgefleckt; unter diesen Bedingungen haben die Spots einen Durchmesser von 180 bis 200 μm.
   4. Lassen Sie die Objektträger nach dem Drucken mindestens 30 Minuten bei Raumtemperatur, um sie trocknen zu lassen, und lagern Sie sie dann bei 4 °C; für die Arbeit vor Ort können die Objektträger transportiert und mehrere Monate bei Umgebungstemperatur gelagert werden.
      HINWEIS: Der CYANOCHIP wird in einem dreifachen Spot-Microarray-Format mit 3 x 8 identischen Microarrays pro Objektträger oder 9 identischen Arrays in einem 1 x 9 Microarray-Format gedruckt. Jede Array-Größe darf nicht höher sein als die Reaktionskammerabmessungen für eine 24-Well-Dichtung (normalerweise 7,5 x 6,5 mm in einer 3 x 8-Hybridisierungskammer).
   5. Bevor Sie den Microarray zur Analyse von Umweltproben verwenden, verwenden Sie einen Fluoreszenz-Sandwich-Microarray-Immunoassay (FSMI), um die Arbeitsverdünnung für jeden Antikörper in einer Titrationskurve zu bestimmen. Für jeden Antikörper wird eine Standardkonzentration des entsprechenden Immunogens (10³ - 10⁴ Zellen/ml) und serielle Verdünnungen des fluoreszierenden Antikörpers (zwischen 1:500 und 1:32.000) verwendet. Die optimale Antikörperkonzentration entspricht 50 % der maximalen Signalintensität, die in der Titrationskurve erhalten wird. Außerdem muss die Sensitivität und Spezifität für jeden Antikörper bestimmt werden, wie in Blanco et al. beschrieben.

>6. Herstellung von Umwelt-Multianalytextrakten für den Fluoreszenz-Sandwich-Microarray-Immunoassay (FSMI)

1. Multianalyt-Extrakt aus einer flüssigen Probe
   1. Entnehmen Sie 1 - 100 mL der flüssigen Probe mit einer sterilen Spritze (z. B. Wasser aus dem Ufer eines Wasserreservoirs); die Probenmenge hängt stark von der potenziellen Konzentration der Ziele ab.
   2. Konzentrieren Sie die Zellen, indem Sie die Wasserprobe durch einen Polycarbonatfilter mit einer Porengröße von 3 μm und einem Durchmesser von 47 mm leiten. Eine zelluläre Konzentration zwischen 10³ und 10⁸ Zellen/ml ist für einen positiven Nachweis wünschenswert, aber die tatsächliche Konzentration ist unbekannt.
   3. Die im Filter gesammelte Biomasse wird mit 1 ml einer modifizierten Tris-gepufferten Kochsalzlösung, Tween 20-verstärktem Puffer (TBSTRR; 0,4 M Tris-HCl (pH 8), 0,3 M NaCl und 0,1 % Tween 20) zurückgewonnen, indem Sie sie mit einem Spatel in ein 15-ml-Röhrchen schaben.
   4. Homogenisieren und disaggregieren Sie mit einem tragbaren Ultraschallprozessor, wie in Schritt 1.5 beschrieben, oder einfach durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren; dies bereitet die Probe für die Analyse durch den Microarray vor.
2. Multianalyt-Extrakt aus einer festen Probe
   1. Wiegen Sie bis zu 0,5 g der festen Probe (z. B. Gestein, Boden oder Sedimente) in ein 10-ml-Röhrchen und fügen Sie bis zu 2 ml TBSTRR hinzu.
   2. Beschallung durch Eintauchen der Sonde in das Rohr, durch Eintauchen des Rohrs in das Wasserbad eines leistungsstarken Ultraschallhorns oder durch Verwendung eines tragbaren Ultraschallgeräts. Führen Sie mindestens 5 x 30-s-Zyklen bei 30 kHz durch und stoppen Sie für 30 s, während Sie sich auf Eis befinden.
   3. Filter zum Entfernen von Sand, Ton und anderen groben Materialien mit einer 10-ml-Spritze, die mit einem Nylonfilterhalter mit einem Durchmesser von 10 bis 12 mm und einer Porengröße von 5 bis 20 μm gekoppelt ist. Schieben Sie die Probe durch den Filter in ein 1,5-ml-Röhrchen. Wenn der Filter gesättigt ist, rühren Sie die Suspension in der Spritze und geben Sie sie in eine neue. Dadurch wird das Filtratmaterial für den Immunoassay vorbereitet (Schritt 7).
      HINWEIS: Die Pufferkapazität von TBSTRR hängt von der Art der Probe ab. Es ist wichtig, den Immunoassay unmittelbar nach der Herstellung des Umweltextrakts durchzuführen, um die Auswirkungen des enzymatischen Abbaus auf die Analyten zu vermeiden. Alternativ können Sie Proteasehemmer in den Umweltextrakt geben und bis zum nächsten Schritt bei -80 °C einfrieren.

>7. Fluoreszierender Sandwich-Microarray-Immunoassay (FSMI)

1. Blockieren des CYANOCHIP
   HINWEIS: Behandeln Sie die gedruckten Objektträger unmittelbar vor der Verwendung, um alle freien Epoxidgruppen auf dem Objektträger zu blockieren und den Überschuss an nicht-kovalent gebundenen Antikörpern zu entfernen.
   1. Tauchen Sie den Microarray 5 Minuten lang in 0,5 M Tris-HCl (pH 9) mit 5 % (w/v) BSA-Lösung auf einer sauberen Oberfläche (z. B. Petrischale oder ein 50-ml-Röhrchen) unter leichtem Rühren von einer Wippenplattform ein. Alternativ können Sie den Objektträger auf einen 100- bis 200-μl-Tropfen der obigen Lösung legen, wobei die Microarray-Spots darauf zeigen. 3 - 5 Minuten einwirken lassen und dann fortfahren.
   2. Heben Sie den Objektträger vorsichtig mit einer Pinzette mit Kunststoffspitze auf und vermeiden Sie es, die Microarray-Zonen zu berühren. Beseitigen Sie den Flüssigkeitsüberschuss, indem Sie den Objektträger vorsichtig auf ein Papiertuch klopfen. Tauchen Sie es 30 Minuten lang in 0,5 M Tris-HCl (pH 8) mit 2 % (w/v) BSA-Lösung unter leichtem Rühren von einer Wippenplattform.
   3. Trocknen Sie den Objektträger, indem Sie eine kurze Zentrifugation (200 - 300 x g für 1 min) mit einer handelsüblichen Mikrozentrifuge durchführen, die für Objektträger geeignet ist. Alternativ können Sie die Folie trocknen, indem Sie leicht auf ein Papiertuch klopfen.
2. Inkubation des Multianalyt-Probenextrakts mit dem Microarray
   1. Richten Sie den Objektträger in einer kommerziellen Microarray-Hybridisierungskassette mit 24 Wells für mehrere Microarrays ein. Befolgen Sie die Anweisungen des Anbieters.
   2. Nach dem Zusammenbau von Objektträger und Kassette pipettieren Sie bis zu 50 μl des Probenextrakts oder eine Verdünnung davon in TBSTRR in jede Vertiefung der Kassette.
   3. Schritt 7.2.2 ist für jede zu analysierende Probe zu wiederholen.
   4. Als Blindkontrolle pipettieren Sie 50 μl TBSTRR-Puffer in mindestens zwei separate Vertiefungen der Kassette.
   5. Inkubieren Sie 1 h lang bei Raumtemperatur und mischen Sie es alle 15 Minuten durch Pipettieren oder lassen Sie es unter leichtem Schütteln. Alternativ 12 h bei 4 °C inkubieren.
      HINWEIS: Verwenden Sie andere Inkubationsdichtungen in Abhängigkeit vom Microarray-Muster. Die Zeit und die Temperatur der Inkubation in Schritt 7.2.5 sind empirische Parameter, die normalerweise von der Affinität und Bindungskinetik jedes gepaarten Antigen-Antikörpers abhängen.
3. Waschen
   1. Entnehmen Sie die Proben, indem Sie die Kassette ablegen und vorsichtig auf ein sauberes, saugfähiges Papier klopfen.
   2. Waschen Sie die Vertiefungen, indem Sie jeweils 150 μl TBSTRR hinzufügen, und entfernen Sie den Puffer wie oben.
   3. Wiederholen Sie Schritt 7.3.2 noch dreimal.
4. Inkubation mit Fluoreszenzdetektor-Antikörpern
   1. Es werden 50 μl eines Antikörpergemisches zugegeben, das die 17 Antikörper gegen Cyanobakterienstämme enthält, die jeweils mit dem Fluorochrom in TBSTRR mit 1 % (w/v) BSA markiert sind. Bestimmen Sie die Konzentration jedes fluoreszierenden Antikörpers in der Mischung (von 0,7 bis 2 μg/ml), indem Sie Titrationsexperimente mit jedem Antigen/Antikörper-Paar durchführen.
   1
   2. h bei Raumtemperatur, wie in Schritt 7.2.5 beschrieben, oder 12 h bei 4 °C inkubieren.
5. Auswaschen der fluoreszierenden Antikörper
   1. Entfernen Sie die fluoreszierenden ungebundenen Antikörper, wie in Schritt 7.3 beschrieben.
   2. Zerlegen Sie die Kassette und tauchen Sie den Objektträger für eine schnelle Spülung in 0,1x PBS (z. B. in ein 50-ml-Röhrchen).
   3. Trocknen Sie die Folie wie in Schritt 7.1.3 beschrieben.

>8. Scannen auf Fluoreszenz

1. Scannen Sie den Objektträger auf Fluoreszenz bei maximaler Emissionsfluoreszenzspitze für dunkelroten Fluoreszenzfarbstoff in einem Scanner auf Fluoreszenz. Nehmen Sie mehrere Bilder der Microarrays mit unterschiedlichen Scanparametern auf, in der Regel durch Verringern des Laserverstärkungswerts.
   Anmerkung: Vermeiden Sie gesättigte Spots (> 65.000 Fluoreszenzzahlen) – sie liegen außerhalb des Maßstabs und können zu Quantifizierungsfehlern führen.

Tabelle 1. Liste der Antikörper (Abs) und der cyanobakteriellen Stämme, die zur Herstellung des CYANOCHIPS verwendet werden.

Ab-Code	Immunogen (Stamm)	Bestellung	Lebensraum	Mittel	Kulturelle Bedingungen
K1	Anabaena sp.	Nasenlöcher	unbekannt	BG11 und Nitrat	30 ºC, Dauerlicht
K2	Anabaena sp.	Nasenlöcher	unbekannt	BG11o	30 ºC, Dauerlicht
K3	Microcystis flosaquae	Chroococcales	planktonisch	BG11	28 ºC, Dauerlicht
K4	Microcystis novacekii	Chroococcales	planktonisch	BG11	28 ºC, Dauerlicht
K5	Microcystis aeruginosa	Chroococcales	planktonisch	BG11	28 ºC, Dauerlicht
K6	Aphanizomenon ovalisporum	Nasenlöcher	planktonisch	BG11o	28 ºC, Dauerlicht
K7	Phormidium sp.	Oscillatoriales	benthisch	BG11	18 ºC, 16-8 photoperiodisch
K8	Rivularia sp.	Nasenlöcher	benthisch	CHU-D	18 ºC, 16-8 photoperiodisch
K9	Chamaesiphon sp.	Chroococcales	benthisch	BG11	18 ºC, 16-8 photoperiodisch
K10	Leptolyngbya boryana	Oscillatoriales	benthisch	BG11	18 ºC, 16-8 photoperiodisch
K11	Tolypothrix verzerrt	Nasenlöcher	benthisch	BG11o	18 ºC, 16-8 photoperiodisch
K12	Aphanizomenon aphanizomenoides	Nasenlöcher	planktonisch	BG11o	28 ºC, Dauerlicht
K13	Nostoc sp. (Antarktis)	Nasenlöcher	benthisch	BG11o	13 ºC, 16-8 photoperiodisch
K14	Anabaena sp.	Nasenlöcher	benthisch	BG11o	13 ºC, 16-8 photoperiodisch
K15	Leptolyngbya sp.	Oscillatoriales	benthisch	BG11	13 ºC, 16-8 photoperiodisch
K16	Tolypothrix sp.	Nasenlöcher	benthisch	BG11	13 ºC, 16-8 photoperiodisch
K17	Planktothrix rubescens	Oscillatoriales	planktonisch	nichts	nichts

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Filter mit 0,22 mm Porendurchmesser	Millipore	GSWP04700	Zur Herstellung von Immunogenen
Eppendorf 5424R Mikrozentrifuge	Fisher Scientific		Zur Herstellung von Immunogenen
Phosphatpuffer Kochsalzlösung (PBS) pH 7,4 (10X)	Thermofisher Scientific	70011036	50 mM Kaliumphosphat, 150 mM NaCl, pH 7,4
Ultraschall-Prozessor UP50H	Hielscher		Zur Herstellung von Immunogenen
Vollständiges Freund-Adjuvans	Sigma-Aldrich	Nr. F5881	Immunpotentiator
Unvollendetes Freud-Adjuvans	Sigma-Aldrich	Nr. F5506	Für Boost-Injektionen
Aufreinigungskit für Protein-A-Antikörper	Sigma-Aldrich	PURE1A	Zur Isolierung von IgG
Zentrifugalfiltergeräte MWCO<100 KDa	Millipore	UFC510096-96K	Zur Isolierung von IgG
Dialyseschläuche, benzoyliert	Sigma-Aldrich	D7884-10FT	Zur Isolierung von IgG
Illustra Microspin G-50 Säulen	GE-HealthCare	GE27-5330-02	Zur Isolierung von IgG
Bradford-Reagenz	Sigma-Aldrich	B6916-500 mL	Zur Quantifizierung der Antikörperkonzentration
MicroBCA-Protein-Assay-Kit	Thermo Scientific	Artikel-Nr.: 23235	Zur Quantifizierung der Antikörperkonzentration
Protein-Arraying-Puffer 2X	Whatman (Sigma Aldrich)	Nr. S00537	Druckpuffer; 30-40% Glycerin in 1X PBS mit 0,01% Tween 20
Tween 20	Sigma-Aldrich	Nr. P9416	Nichtionisches Reinigungsmittel
Rinderserumalbumin (BSA)	Sigma-Aldrich	Nr. A9418	Kontrolle für den Druck; Blockierungsreagenz
Mikrotiterplatte mit 384 Vertiefungen	Genetix	X6004	Für den Antikörperdruck
Roboter-Arrayer für mehrere Folien	MicroGrid II TAS Arrayer von Digilab		Für den Antikörperdruck
Glasobjektträger aus Epoxidsubstrat	Arrayit Unternehmen	VEPO25C	Solide Unterstützung für den Antikörperdruck
Alexa Fluor-647 Succinimidyl-ester	Molekulare Sonden	Nr. A20006	Fluorochrom
Dmso	Sigma-Aldrich	Nr. D8418	Fluorochrom-Lösungsmittel
Heidolph Titramax vibrierender Plattformschüttler	Fisher Scientific		Für die Antikörpermarkierung
Illustra Microspin G-50 Säulen	Gesundheitswesen	Tel.: 27-5330-01	Zur Aufreinigung von markierten Antikörpern
Sicherer Verschluss braune 0,5 ml Tuben	Sarstedt	7,27,04,001	Für die Lagerung von markierten Antikörpern
Nanodrop 1000 Spektralphotometer	Thermo Scientific		Zur Quantifizierung der Antikörperkonzentration und der Markierungseffizienz
3 μm Porenfilter aus Polycarbonat mit 47 mm Durchmesser	Millipore	TMTP04700	Um Zellen zu konzentrieren
1M Trizma Hydrochlorid Lösung pH 8	Sigma-Aldrich	Nr. T3038	Für die TBSTR-Vorbereitung; zum Blockieren von Objektträgern
Natriumchlorid	Sigma-Aldrich	Nr. S7653	Für die TBSTRR-Vorbereitung
20 μm Nylon-Filter	Millipore	NY2004700	Für die Zubereitung von Umweltextrakten
10-12 mm Filterhalter	Millipore	SX0001300	Für die Zubereitung von Umweltextrakten
Proteasehemmer-Cocktail	Sigma-Aldrich	Nr. 8340	Für die Lagerung von Extrakten in der Umwelt
1M Trizma Hydrochlorid Lösung pH 9	Sigma-Aldrich	Nr. T2819	So blockieren Sie Folien
Heidolph Duomax 1030 Schaukel-Plattform-Shaker	VWR		Zum Blockieren von Objektträgern; für Inkubationsprozesse
VWR Galaxy Miniarray-Mikrozentrifuge	VWR	C1403-VWR	Zum Trocknen von Dias
Multi-Well-Microarray-Hybridisierungskassette	Arrayit Unternehmen	AHC1X24	Kassette für 24 Assays pro Objektträger
GenePix 4100A Microarray-Scanner	Molekulare Bauelemente		Scanner für Fluoreszenz
GenePix Pro Software	Molekulare Bauelemente		Software zur Bildanalyse und Quantifizierung

kg