Immunfärbung von Zellen, die in einem 3D-Hydrogel-System verkapselt sind

Zusammenfassung

Quelle: LeSavage, B. L., et al. Produktion von Elastin-ähnlichen Proteinhydrogelen zur Verkapselung und Immunfärbung von Zellen in 3D. J. Vis. Exp. (2018).

Dieses Video demonstriert eine Technik zur Immunfärbung von Zellen, die in einem 3D-Hydrogel eingekapselt sind. Die Hydrogelkultur, die neurale Vorläuferzellen enthält, wird fixiert, permeabilisiert und mit einer Blockierungslösung behandelt, um eine unspezifische Immunfärbung zu verhindern. Ein primärer Antikörpercocktail wird zugegeben, um spezifische Proteine zu binden, gefolgt von fluoreszenzmarkierten Sekundärantikörpern und einer Kernfärbung. Die Probe wird dann auf einen Objektträger montiert und unter einem konfokalen Mikroskop betrachtet.

Protokoll

>1. Zellverkapselung in 3D-Hydrogelen aus Elastin-ähnlichen Proteinen (ELP)

1. Vorbereitung von Silikonformen
   1. Mit einem Biopsiestanzer mit dem gewünschten Durchmesser Löcher in eine 0,5 mm dicke Silikonfolie bohren und um jedes Loch ein Quadrat ausschneiden. Wiederholen Sie den Vorgang für die gewünschte Anzahl von Formen.
      HINWEIS: Der Durchmesser und die Dicke der Formen können an die jeweilige Anwendung und die Zellkulturbedingungen angepasst werden. In der Praxis werden für Zellkulturen von 50 x 10⁶ Zellen/ml 0,5 mm dicke Formen mit einem Durchmesser von 4 mm bzw. 5 mm empfohlen, um eine ausreichende DNA/RNA- bzw. Proteinextraktion zu gewährleisten. Für die Immunfärbung kann eine 2-mm-Biopsiestanze verwendet werden, um stattdessen drei benachbarte Löcher pro quadratischer Form zu erzeugen, so dass drei Replikate pro Vertiefung gefärbt werden können.
   2. Entfernen Sie die Plastikfolie auf jeder Seite der einzelnen Form mit einer Pinzette.
      Anmerkung: Vermeiden Sie den Kontakt mit der freiliegenden Silikonoberfläche, da Verunreinigungen die zukünftige Effizienz der Plasmaverklebung verringern können.
   3. Ordnen Sie mit einer Pinzette die gleiche Anzahl blanker Silikonformen und Glasdeckgläser (Nr. 1, 12 mm Durchmesser) in abwechselnden Reihen auf dem umgekehrten Deckel einer 48-Well-Platte an. Decken Sie nach Abschluss des Abschlusses den Deckel der 48-Well-Platte ab, um eine Kontamination zu vermeiden.
   4. Mit Sauerstoffplasma wird der gesamte Deckel der 48-Well-Platte (d. h. Formen und Objektträger) behandelt. Unmittelbar danach verwenden Sie eine Pinzette, um die Silikonform auf das benachbarte Glasdeckglas umzudrehen. Drücken Sie fest auf die Form, um die Verklebung zu gewährleisten. Lassen Sie die Formen bei Raumtemperatur 1 h.
      inkubieren Anmerkung: Die Dauer der Sauerstoffplasmabehandlung variiert je nach verwendetem Instrument. Typische Bedingungen für unser Instrument sind ein Betriebsgasdruckfenster zwischen 0,3 und 4 mbar, ein Sauerstoffgasfluss von 20 cm³/min und eine Plasmaexposition der Probe von 10 bis 20 s.
   5. Sterilisieren Sie die Formen durch Autoklavieren. Lagern Sie die Formen bis zur Verwendung bei Raumtemperatur in einer sterilen Umgebung.
      Anmerkung: Die Formen können in diesem Stadium unbegrenzt gelagert werden.
2. Zubereitung von Elastin-ähnlicher Protein-Stammlösung
   1. Entnehmen Sie lyophilisiertes ELP aus der Lagerung bei 4 °C. Erwärmen Sie das Protein auf Raumtemperatur, bevor Sie das Röhrchen öffnen, um sicherzustellen, dass sich bei wiederholter Anwendung kein Kondenswasser auf dem Protein bildet.
   2. ELP in Dulbeccos phosphatgepufferter Kochsalzlösung (DPBS) bei 4 °C unter ständigem Rühren (d. h. Schleudern) über Nacht auflösen.
      Anmerkung: Die Konzentration der ELP-Stammlösung wird durch Zugabe von Vernetzerlösung in einem benutzerdefinierten Volumenverhältnis weiter verdünnt. Bereiten Sie beispielsweise für eine ELP-Endkonzentration von 3,75 % (w/v) eine ELP-Stammlösung von 3,75 % (w/v) vor, die bei einem Volumenverhältnis von 4:1 ELP-Lösung:Vernetzerlösung verdünnt wird. Passen Sie die Konzentration nach Bedarf für die gewünschte Anwendung an.
   3. Steriler Filter ELP-Stammlösung mit einem 0,22 μm Spritzenvorsatzfilter. Lagern Sie ELP bei Nichtgebrauch auf Eis.
3. Übertragen Sie die sterilen Formen in der Biosicherheitswerkbank mit einer sterilen Pinzette auf eine 24-Well-Gewebekulturplatte.
4. Zubereitung von Tetrakis(hydroxymethyl)phosphoniumchlorid (THPC)-Stammlösung
   1. Verdünnen Sie THPC kurz vor der Verwendung in DPBS. Passen Sie die Konzentration der THPC-Lösung entsprechend der endgültigen ELP-Konzentration und dem gewünschten Vernetzungsverhältnis an.
      Anmerkung: Für das Protokoll wird eine endgültige ELP-Konzentration von 3 % (w/v) durch Mischen der ELP-Stammlösung mit der THPC-Lösung in einem volumetrischen Verhältnis von 4:1 erreicht. Passen Sie es nach Bedarf an.
   2. 2,6 μl THPC-Lösung (80 % in Wasser) zu 997,4 μl DPBS.
      Anmerkung: Diese Konzentration von THPC entspricht einem stöchiometrischen Verhältnis von 1:1 von Hydroxymethylgruppen auf THPC und primären Aminen auf dem ELP-Protein, wenn Lösungen mit dem beschriebenen Volumenverhältnis von 4:1 für ein abschließendes 3% (w/v) ELP-Hydrogel gemischt werden. Die THPC-Lösung ist viskos und Tröpfchen der Lösung können an der Seite der Pipettenspitze haften bleiben. Vermeiden Sie für genaue Konzentrationen solche Tröpfchen beim Verdünnen in DPBS. Spülen Sie den THPC-Vorratsbehälter mit Stickstoffgas, um eine Oxidation des Phosphins und eine Inaktivierung des Vernetzers zu verhindern.
   3. Die Lösung zum Mischen und auf Eis halten.
   4. Sterilfiltrieren Sie die THPC-Stammlösung mit einem 0,22-μm-Spritzenvorsatzfilter. Verdünnen Sie die THPC-Stammlösung weiter mit sterilem DPBS, um niedrigere stöchiometrische Vernetzungsverhältnisse (z. B. 0,5:1 oder 0,75:1) zu erzielen.
      Anmerkung: THPC ist sauerstoffempfindlich und die verdünnte Lösung sollte innerhalb weniger Stunden nach der Zubereitung verwendet werden.
5. Dissoziieren Sie die Zellen durch Inkubation mit Trypsin-EDTA in eine Einzelzellsuspension, pelletieren Sie die Zellen und zählen Sie die im Medium resuspendierten Zellen mit einem Hämozytometer.
   Anmerkung: Die genauen Protokolle für diesen Schritt hängen stark vom gewünschten Zelltyp und der gewünschten Anwendung ab. Für die neuralen Vorläuferzellen, die in diesem Protokoll verwendet wurden, wurde eine 0,025%ige Trypsin-EDTA-Inkubation bei Raumtemperatur für 1,5 Minuten durchgeführt. Die Zellen wurden bei 200 x g für 2 min pelletiert. Um die Lebensfähigkeit der Zellen zu erhöhen, sollten die Zellen unter normalen mittleren Bedingungen suspendiert werden. Typische Zelldichten, die für die Zellverkapselung verwendet werden, reichen von 1 - 50 x 10⁶ Zellen/ml des endgültigen Hydrogelvolumens. Passen Sie es nach Bedarf an.
6. Aliquotieren Sie die gewünschte Anzahl von Zellen in ein steriles 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen.
7. Zentrifugieren Sie die Zellen bei ~200 x g für 3 min. Saugen Sie den Überstand vorsichtig an und halten Sie das Zellpellet auf Eis.
   Anmerkung: Es ist wichtig, den gesamten Überstand vollständig abzusaugen, um die weitere Verdünnung des ELP- und THPC-Vernetzers zu mildern. Spezifische Zentrifugationsgeschwindigkeiten variieren je nach Zelltyp.
8. Suspendieren Sie das Zellpellet wieder in der ELP-Stammlösung, so dass das Volumen 80 % des endgültigen Volumens beträgt (unter der Annahme eines Verhältnisses von 4:1 von ELP-Lösung:THPC-Lösung). Mischen Sie 20-25 Mal, um eine homogene Mischung aus den Zellen und ELP.
   zu erhalten. Anmerkung: Vermeiden Sie es, den Boden des Rohrs zu greifen, um den Temperaturanstieg und den anschließenden Phasenübergang von ELP zu mildern. Jede 2-mm-Form mit drei Replikaten benötigt 7,5 μl Endvolumen (d. h. 6 μl ELP-Stammlösung und 1,5 μl THPC-Stammlösung), die zu gleichen Teilen auf die 3 Löcher aufgeteilt werden (d. h. 2,5 μl Endvolumen pro Loch). Für die 4- und 5-mm-Werkzeuge ist ein Endvolumen von 7,5 μl bzw. 15,5 μl erforderlich.
9. Geben Sie THPC-Stammlösung zur Zell-/ELP-Suspension für die verbleibenden 20 % des Endvolumens. Mischen Sie 20-25 Mal, um eine homogene Mischung zu erhalten.
10. Pipettieren Sie sofort die entsprechenden Endvolumina der Zell-/ELP-/THPC-Mischung in kreisenden Bewegungen in jede Form. Wiederholen Sie den Vorgang für alle Formen.
11. Inkubieren Sie die Proben 15 min lang bei Raumtemperatur, gefolgt von einer zusätzlichen Inkubation bei 37 °C für 15 min.
    Anmerkung: Die erste Inkubationsphase wird dazu beitragen, die anfängliche Vernetzung des Hydrogels zu erleichtern, bevor die Temperatur auf einen Wert über der unteren kritischen Lösungstemperatur (LCST) des ELP angehoben und seine thermische Phasentrennung induziert wird.
12. Geben Sie langsam 750 μl warmes Zellkulturmedium in jede Vertiefung der 24-Well-Platte, um eine Beschädigung der Gele zu vermeiden.
13. Inkubieren Sie die Hydrogele 7 Tage lang bei 37 °C.
    Anmerkung: Je nach Zelltyp wird ein vollständiger Wechsel des Mediums alle 1-2 Tage empfohlen. Um die Belastung des Gels zu begrenzen, verwenden Sie eine Pasteurpipette aus Glas, die mit einer 200-μl-Pipettenspitze befestigt ist, wenn Sie Medium aus der Vertiefung ansaugen.

2. Immunzytochemie von Zellen in 3D-ELP-Hydrogelen

1. Bereiten Sie die Fixierlösung vor, indem Sie 10 mL 16 % (w/v) Paraformaldehyd (PFA) in 30 ml DPBS mischen. Erwärmen Sie die Lösung auf 37 °C.
2. Saugen Sie das Medium aus der 24-Well-Platte an und waschen Sie es vorsichtig mit 1 ml DPBS.
3. 750 μl der Fixierlösung in jede Vertiefung geben und 30 Minuten lang bei 37 °C inkubieren. Verwenden Sie den Gewebekultur-Inkubator nicht, um eine Kontamination anderer Kulturen mit PFA-Dampf zu vermeiden.
4. Saugen Sie die Fixierungslösung vorsichtig aus jeder Vertiefung ab und entsorgen Sie das PFA in einen geeigneten Behälter für gefährliche Abfälle.
   Vorsicht: Die Exposition gegenüber PFA kann zu Haut- und Augenreizungen führen. Tragen Sie Handschuhe/Schutzbrille und arbeiten Sie in einem chemischen Abzug.
5. Geben Sie 1 ml DPBS zu jeder Probe. Saugen Sie das DPBS sofort an und entsorgen Sie es in den PFA-Abfallbehälter.
6. Waschen Sie die Proben zweimal mit 1 mL DPBS für jeweils 10 Minuten.
   Anmerkung: Die Proben können nach dem Versiegeln der Platte mit Parafilm bis zu einer Woche bei 4 °C in DPBS gelagert werden.
7. Permeabilisieren Sie jede Probe mit 750 μl Permeabilisierungslösung (100 mL DPBS und 0,25 mL Triton X-100; PBST) für 1 h bei Raumtemperatur auf einer Wippe bei 15 U/min.
8. Aspirieren Sie das PBST und fügen Sie jeder Probe 750 μl Blockierungslösung (95 ml PBS, 5 g Rinderserumalbumin (BSA), 5 ml Serum und 0,5 ml Triton X-100) hinzu. Bei Raumtemperatur 3 h auf einer Wippe bei 15 U/min inkubieren.
   Anmerkung: Die Blockierungslösung sollte Serum von der Wirtsspezies enthalten, in der die Sekundärantikörper aufgezogen wurden (z. B. Ziege, Esel) und vor der Verwendung durch einen 0,22-μm-Filter sterilfiltriert wurde.
9. Bereiten Sie die Antikörperverdünnungslösung vor (97 ml DPBS, 2,5 g BSA, 2,5 ml Serum (von derselben Wirtsspezies, aus der EPL hergestellt wurde) und 0,5 ml Triton X-100). Verdünnen Sie den Primärantikörper mit der Antikörperverdünnungslösung und fügen Sie jeder Probe 500 μl der Lösung hinzu. Die Platte mit Parafilm verschließen und über Nacht bei 4 °C auf einer Wippe inkubieren.
   Anmerkung: Die Primärantikörper Nestin und Sox2 wurden in Antikörperverdünnungslösung 1:400 von der ursprünglichen Konzentration des Herstellers verdünnt.
10. Aspirieren Sie die Antikörperlösung aus jeder Probe und waschen Sie die Proben 60 Minuten lang bei Raumtemperatur auf einer Wippe bei 15 U/min mit PBST. Wiederholen Sie den Waschschritt 3 Mal.
11. Verdünnen Sie die Sekundärantikörper und 5 mg/ml Stamm-DAPI (1:2.000) mit der Antikörperverdünnungslösung und geben Sie 500 μl der Lösung zu jeder Probe. Die 24-Well-Platte mit Alufolie abdecken und über Nacht bei 4 °C auf einer Wippe inkubieren.
    Anmerkung: Da die Sekundärantikörper lichtempfindlich sind, müssen die Proben für alle nachfolgenden Schritte vor Photobleaching geschützt werden. Ziegen-Anti-Maus- und Ziegen-Anti-Kaninchen-Sekundärantikörper wurden 1:500 in Antikörperverdünnungslösung von der ursprünglichen Konzentration des Herstellers verdünnt.
12. Aspirieren Sie die Antikörperlösung aus jeder Probe und waschen Sie die Proben 30 Minuten lang bei Raumtemperatur auf der Wippe mit PBST. Wiederholen Sie den Waschschritt 3 Mal.
13. Positionieren Sie einen Tropfen des fest abbindenden Einbettmediums auf der Oberfläche eines Objektträgers. Entfernen Sie mit einer Pinzette überschüssige Lösung aus der Form, indem Sie den Rand der Form leicht auf einem Papiertuch abtupfen. Stellen Sie die Form vorsichtig kopfüber auf das Einbettmedium und vermeiden Sie das Einbringen von Blasen.
14. Lassen Sie das Einbettmedium 48 h bei Raumtemperatur aushärten. Lagern Sie die Proben bei Raumtemperatur oder 4 °C. Lassen Sie das Eindeckmedium 48 Stunden lang vollständig aushärten, bevor Sie es aufnehmen, da sich der Brechungsindex des Mediums im Laufe der Aushärtung ändert. Versiegeln Sie die Proben mit klarem Nagellack auf dem Glasdeckel, um Verunreinigungen oder Probenbewegungen zu verringern.
15. Bilden Sie die Proben mit einem konfokalen Mikroskop ab.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Zellverkapselung in 3D-ELP-Hydrogelen
0,22 μm Spritzenvorsatzfilter	Millipore	SLGV004SL
0,5 mm dicke Silikonplatte	Wissenschaft der Elektronenmikroskopie	Artikel-Nr.: 70338-05
24-Well-Gewebekulturplatten	Corning	353047
Einweg-Biopsie-Stanze (2 mm)	Integra Miltex	33-31
Einweg-Biopsie-Stanze (4 mm)	Integra Miltex	33-34
Einweg-Biopsie-Stanze (5 mm)	Integra Miltex	33-35
Dulbecco-Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (DPBS)	Corning	21-031-CM
Nr. 1 12 mm Glasdeckgläser	Thermo Fisher Scientific	Tel.: 12-545-80
Tetrakis(hydroxymethyl)phosphoniumchlorid (THPC)	Sigma-Aldrich	Artikel-Nr.: 404861-100ML
0,5 % Tryspin/EDTA	Thermo Fischer	15400054
Immunzytochemie von Zellen in 3D-ELP-Hydrogelen
16% (w/v) Paraformaldehyd (PFA)	Elektronenmikroskopie	Artikel-Nr.: 15701
Rinderserumalbumin (BSA)	Roche	3116956001
DAPI (4',6-Diamidino-2-phenylindol, Dihydrochlorid)	Molekulare Sonden	Nr. D1306
Esel-Serum	Lampire Biologische Labore	Artikel-Nr.: 7332100
Ziegen-Anti-Maus-Sekundärantikörper (AF488)	Molekulare Sonden	Nr. A-11017
Ziegen-Anti-Kaninchen-Sekundärantikörper (AF546)	Molekulare Sonden	Nr. A-11071
Ziegen-Serum	Gibco	Artikel-Nr.: 16210-072
Maus Nestin Primärer Antikörper	BD Pharmingen	556309
Maus Sox2 Primärer Antikörper	Zell-Signaltechnik	23064S
Nagellack	Elektronenmikroskopie	Artikel-Nr.: 72180
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100-100ML
Vectashield Hardset Einbettmedium	Vektor-Labore	H-1400

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