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>1. Antikörper-Peptid-Konjugation
HINWEIS: Cholsäure, die an NLS gebunden ist (ChAcNLS), kann bei jedem kommerziellen Peptidhersteller oder einer universitären Peptidsynthese-Serviceplattform synthetisiert werden.
- Bereiten Sie in einem 1,7-ml-Mikrozentrifugenröhrchen eine 10 mg/ml-Lösung (~1 mg Gesamtantikörper) von 7G3 in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) mit einem pH-Wert von 7,6 vor.
- Sulfosuccinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)cyclohexan-1-carboxylat (Sulfo-SMCC) in Dimethylsulfoxid (DMSO) in einer Konzentration von 5-10 mM lösen. Das gründliche Vortexen der Lösung funktioniert am besten, um eine vollständige Auflösung zu erreichen.
- In das Röhrchen, das 7G3 enthält, wird die gelöste Schwefel-SMCC-Lösung gegeben (typischerweise zwischen 5 und 20 μl, abhängig vom gewünschten molaren Verhältnis von Sulfo-SMCC-zu-7G3). Es wird empfohlen, Sulfo-SMCC-zu-7G3-Verhältnisse von 10, 25 und 50 zu 1 zu testen. 1 h bei Raumtemperatur inkubieren.
- Reinigung und Konzentration des Maleimid-derivatisierten 7G3 unter Verwendung eines Ultrafiltrationsgeräts und Pufferaustauschs in PBS, pH 7,0. Zentrifugieren Sie bei 8.000 x g für ca. 5 min. Verwerfen Sie den Durchfluss und füllen Sie ihn mit PBS, pH 7,0 und zentrifugieren Sie erneut.
- Führen Sie dies 7-8 Mal durch, um den Puffer vollständig auszutauschen. Gewinnen Sie das konzentrierte 7G3-Protein zurück, indem Sie das Filtergerät kopfüber in ein sauberes Mikrozentrifugenröhrchen legen. 2 min bei 1.000 x g zentrifugieren. Das Wiederherstellungsvolumen sollte ca. 0,3 ml betragen.
- In das Röhrchen, das das Maleimid-aktivierte 7G3 enthält, wird ein 2-facher molarer Überschuss an ChAcNLS im Verhältnis zu dem im vorherigen Schritt verwendeten Sulfo-SMCC-zu-7G3-Verhältnis hinzugefügt und über Nacht bei 4 °C inkubiert. Wenn z. B. ein Sulfo-SMCC-zu-7G3-Verhältnis von 10 zu 1 verwendet wurde, verwenden Sie ein Verhältnis von 20 zu 1 ChAcNLS zu 7G3. Die Gesamtlautstärke sollte nicht wesentlich verändert werden.
Anmerkung: Obwohl ChAcNLS während des Konjugationsprozesses keine Ausfällung verursacht, ist dies eine Möglichkeit, die auch bei anderen Peptiden auftreten könnte. Beobachten Sie das Röhrchen während der Reaktion auf Anzeichen von Ausfällung, die höchstwahrscheinlich verursacht werden, wenn Peptide hydrophob sind. In diesen Fällen kann es sich lohnen, das interessierende Peptid erneut zu betrachten, um Änderungen zu entwerfen, die eine erhöhte Hydrophilie ermöglichen.
- Konzentrieren Sie das 7G3-ChAcNLS mit einem Ultrafiltrationsgerät auf die gewünschte Konzentration und den Pufferaustausch in PBS pH 7,4 (siehe Schritt 1.4). Die Rückgewinnungsausbeute des Gesamtproteins sollte ≥ 75 % des ursprünglichen Ausgangsmaterials betragen.
- Durchführung einer Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) zur Evaluierung der konstruierten 7G3-ChAcNLS-Kandidaten unter Verwendung eines 12%igen Polyacrylamidgels (bietet eine ausreichende Trennung der ChAcNLS-konjugierten schweren und leichten Ketten von nicht konjugierten Ketten). 10 μg 7G3-ChAcNLS in einen PAGE-Ladepuffer mit 2 μl β-Mercaptoethanol mischen und in die Vertiefung füllen.
- Stellen Sie die entsprechende Spannung ein (120 V für 1 h für ein 12%iges Gel) und führen Sie die Elektrophorese durch. Stoppen Sie die Elektrophorese, wenn die Coomassie-Farbstofffront den Boden des Gels erreicht.
Anmerkung: Lass die Coomassie Dye Front nicht vom Gel ablaufen.
- Das Gel aus dem Elektrophoresegerät nehmen und mit einer Entfärbungslösung spülen, die 10 % v/v Eisessig und 20 % v/v Methanol enthält.
- Machen Sie ein Foto des Gels und messen Sie mit einem Lineal den Abstand (cm), der für die Standards und 7G3-Konjugate migriert wurde. Berechnen Sie den Wert des Retentionsfaktors (Rf), d. h. die migrierte Strecke geteilt durch die Gellänge (von wo aus das Protein zur Coomassie-Migrationsfront geladen wird). Plotten Sie das Molekulargewicht (MW) in log gegen die Rf-Werte jedes Proteinstandards und extrapolieren Sie die Größe der 7G3-Konjugate.
- Berechnen Sie die Anzahl der Peptide pro Antikörper, indem Sie die Differenz in MW zwischen 7G3-Konjugaten und unmodifiziertem 7G3 durch 1768,5 g/mol (MW von ChAcNLS) dividieren.
- Machen Sie digitale Bilder des Coomassie-gefärbten Gels und führen Sie eine Densitometrie-Analyse durch. Zu diesem Zeitpunkt kann die Auswahl eines Leitkandidaten auf dem AC mit der maximalen Anzahl von ChAcNLS-Molekülen basieren, die keine signifikanten Aggregatspezies enthalten.
>2. Konfokale Mikroskopie zur Bewertung der intrazellulären Akkumulation
HINWEIS: Es ist wichtig, die Zellselektivität der intrazellulären Akkumulation der peptidmodifizierten mAbs zu testen, bevor Formulierungen mit einer Nutzlast von Interesse entwickelt werden. Da auch gezeigt wurde, dass Tat eine Neigung zur unspezifischen Zellpenetration hat, lohnt es sich, zunächst die intrazelluläre Akkumulation und Zellselektivität zu analysieren, bevor kostspielige Entwicklungsschritte mit teuren Nutzlasten unternommen werden. Aus diesem Grund sollte Prozedur 1 auch isotypspezifische irrelevante Kontroll-mAbs modifizieren. Für den Rest des Protokolls werden wir mit ACs arbeiten, die mit 10 ChAcNLS-Molekülen pro Antikörper modifiziert sind. Ein Schema mit den wichtigsten Schritten für die Prozeduren 2 und 3 ist in Abbildung 1 beschrieben.
VORSICHT: Dieser Schritt des Protokolls beinhaltet die Handhabung und Manipulation von Paraformaldehyd. Bitte beachten Sie bei der Handhabung die Herstellerangaben.
- Behandlung von TF-1a-Zielzellen mit 200 nM 7G3-ChAcNLS, einschließlich modifizierter Kontroll-mAbs. 5 x 106 antigen-positive Zellen mit den Konjugaten für 1 h bei 37 °C inkubieren.
- Nach 1 h den Überstand entfernen und mit 1 mL 3x in eiskaltem PBS waschen. Frisches Medium hinzufügen und eine weitere Stunde bei 37 °C inkubieren.
- Nach der zusätzlichen Stunde den Überstand entfernen und 3x in 1 mL eiskaltem PBS waschen. Zugabe von 0,5 ml PBS mit 0,25 % Trypsin und Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) bei 37 °C für 3 bis 30 min.
Anmerkung: Während der ersten Pilotversuche wird empfohlen, Zellen nicht zu trypsinisieren, um die Unterschiede in der intrazellulären AC-Akkumulation zu bestimmen. Dieses Protokoll fördert die Verwendung von Trypsin, und wir zeigen, wie dies die Bewertung der intrazellulären Akkumulationseffizienz verschiedener AC-Kandidaten verbessert.
- Testen Sie die verschiedenen Inkubationszeiten, indem Sie visuell überprüfen, ob alle Zellen abgelöst werden. Darüber hinaus können Zellaliquote mit Viabilitätsfärbelösungen inkubiert und durchflusszytometrische Analysen wie zuvor beschrieben durchgeführt werden.
- Neutralisieren Sie Trypsin mit 1,5 ml Zellkultur-RPMI 1640 media/10 % fötalem Rinderserum. Zellen bei 500 x g für 5 min zentrifugieren, Überstand entfernen und 3x in 0,5 mL eiskaltem PBS waschen.
- Zellen in 0,5 mL PBS mit 1 % Paraformaldehyd und 1 % Saccharose für 30 min auf Eis fixieren. Zellen 3x in 0,5 mL eiskaltem PBS waschen und 5 min bei 250 x g zentrifugieren. Zellen in 0,5 mL PBS mit 0,15 % Triton X-100 für 5 min auf Eis permeabilisieren. Waschen Sie die Zellen in eiskaltem PBS und wiederholen Sie die Zentrifugation.
- Suspendieren Sie die Zellen in 0,1 ml PBS, die 2 μg/ml (oder die vom Hersteller empfohlene Konzentration) eines anti-murinen (isotypspezifischen) sekundären polyklonalen Fc-Antikörpers, der an AlexaFluor 647 konjugiert ist, für 1 h bei Raumtemperatur im Dunkeln.
- Zentrifugieren Sie bei 250 x g für 5 min und waschen Sie die Zellen 3x in 0,5 mL eiskaltem PBS. Suspendieren Sie die Zellen in 0,5 mL PBS.
Pause: Die Zellen können im Kühlschrank aufbewahrt werden.
Anmerkung: Es ist wichtig, einen Sekundärantikörper auszuwählen, der den korrekten Isotyp des interessierenden mAb erkennt. AF647 wurde aufgrund seiner Ferninfrarot-Emission ausgewählt, die die Propidiumiodid (PI)-Färbung des Zellkerns nicht beeinträchtigt.
- Geben Sie PI in einer Konzentration von 10 μg/ml in den Behälter mit den Zellen. Montieren Sie anschließend 1 x 105 Zellen mit Montagemedien auf Objektträger und decken Sie sie mit einem Glasdeckglas ab.
- Untersuchen Sie Zellen mit einem Plan Apo 60X Ölimmersionsobjektiv NA 1.42 an einem konfokalen Invers-Laser-Scanning-Mikroskop. Detektieren Sie PI-Fluoreszenz mit dem 488-nm-Argonlaser und dem spektralen Scanning-Prisma-Set für 600 - 650 nm. Für die AF647-Fluoreszenz verwenden Sie den 633 nm Helium-Neon-Laser und das spektrale Scanning-Prismen-Set für 650 - 700 nm. Erfassen Sie die Fluoreszenzemissionen von PI und AF647 nacheinander.
Anmerkung: Verwenden Sie die gleiche Einstellung für die gesamte Auswertung und den Vergleich der Zellen. Sie müssen jedoch die Einstellungen für trypsinisierte Zellen im Vergleich zu nicht trypsinisierten Zellen anpassen.
- Verwenden Sie Mikroskopsoftware, um Bilder aufzunehmen. Erfassen Sie Bilder mit seriellen horizontalen optischen Schnitten von 1.024 x 1.024 Pixeln mit einer 2-fachen Mittelwertbildung, die in Abständen von 0,5 μm über die gesamte Zelldicke gemessen wird. Präsentieren Sie die Bilder als gestapelte Z-Projektionen aus vier aufeinanderfolgenden Schichten bei maximaler Fluoreszenzintensität.
- Analysieren Sie Zellen mit Mikroskopsoftware. Zeichnen Sie das zelluläre Verteilungsmuster der Konjugate auf. Bewerten Sie insbesondere, ob die intrazelluläre Fluoreszenz im Zytoplasma gruppiert und nahe der Zelloberfläche oder diffus und homogen ist. Bewerten Sie auch die relative Fluoreszenzintensität pro Zelle.
