Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. Kathetervorbereitung vor der stereotaktischen Chirurgie
- Schneiden Sie PE50-Katheter (6 cm lang), die zum Verbinden der Kanüle mit osmotischen Pumpen verwendet werden (siehe Abbildung 1). Füllen Sie die PE50-Katheter mit künstlicher Zerebrospinalflüssigkeit (aCSF) und verschließen Sie beide Enden der Katheter. Halten Sie den Katheter bis zur Verwendung bei 4 °C.
>2. Kanülenimplantation durch Stereotaxie
- Führen Sie die Operation unter sterilen Bedingungen durch. Sterilisieren Sie alle chirurgischen Instrumente und Materialien durch Autoklavieren. Reinigen Sie das stereotaktische Gerät und den Arbeitsbereich gründlich und desinfizieren Sie es mit einer 70%igen Ethanollösung. Tragen Sie eine chirurgische Maske, eine Haarhaube und sterile Handschuhe.
- Anästhesieren Sie Ratten, indem Sie intraperitoneal (i.p.) eine Lösung von Ketamin und Xylazin (100 mg/kg bzw. 10 mg/kg) injizieren. Bestätigen Sie die Anästhesie, indem Sie die Bewegung nach einem sanften Zehenkneifen überprüfen.
- Injizieren Sie dem anästhesierten Tier mindestens 30 Minuten vor der Operation ein nichtsteroidales entzündungshemmendes Arzneimittel (Meloxicam; 1 mg/kg) subkutan (s.c.).
- Rasieren Sie den Kopf des Tieres mit einer Schermaschine und desinfizieren Sie die Haut dreimal mit einer Lösung aus Chlorhexidingluconat 2 % und Isopropylalkohol 2 %. Tragen Sie veterinärmedizinische Augensalbe auf die Augen auf, um Trockenheit während der Narkose zu verhindern.
- Platzieren Sie das Tier mit den Ohrbügeln auf einem stereotaktischen Rahmen. Befestigen Sie eine Kanüle am Halterarm des stereotaktischen Rahmens. Injizieren Sie (s.c.) ein Lokalanästhetikum (Bupivacain (1,5 mg/kg) und Lidocain (1,5 mg/kg) auf den Oberkopf. Die Anästhesie wird während des gesamten Eingriffs aufrechterhalten, indem ein Nasenkonus platziert wird, der 3% Isofluran liefert. Das gesamte Operationsfeld sollte abdrapiert werden, aber das wurde hier nicht gemacht, um die Technik besser zu demonstrieren.
- Machen Sie mit einem Skalpell einen Schnitt von 3 cm an der Oberseite des Kopfes. Installiere 4 Klammern um den Schnitt, um den Schädel frei zu lassen. Mit einer Schere mit runder Spitze eine Tasche (2 x 2 cm2) unter die Haut zwischen den Schulterblättern des Tieres bohren.
- Kratzen Sie das Periost des Schädels mit einer Klinge ab. Tragen Sie ein Mullkissen auf den Schädel auf, wenn er blutet.
- Stellen Sie sicher, dass der Schädel flach und gut ausgerichtet auf dem stereotaktischen Rahmen ist. Um sicherzustellen, dass der Schädel flach ist, überprüfen Sie die Höhenkoordinaten am Bregma und Lambda. Nehmen Sie die Bregma-Koordinaten, die als Referenzpunkt verwendet werden.
- Berechnen Sie ausgehend vom Bregma die Koordinaten der beiden Führungskanülen, die bilateral in den Hippocampus implantiert werden (anteroposterior: - 0,42 cm; mediolateral: ± 0,30 cm; dorsoventral: - 0,28 cm gemäß dem Rattenhirnatlas von Paxinos und Watson). Markieren Sie die Position der Kanüle mit einem Marker.
- Bohren Sie ein Loch (0,5 mm) in den Schädel an der Implantationsstelle beider Kanülen. Bohren Sie zwei weitere Löcher ca. 5 mm über und unter diesen Punkten, um Schrauben einzusetzen, die die Kanüle beim Auftragen von Zahnzement verfestigen.
- Schneiden Sie mit einem Skalpell ein Ende des zuvor mit aCSF gefüllten Katheters ab und führen Sie es in den Winkelarm der Kanüle ein. Befestigen Sie die erste Kanüle mit Zahnzement. Vermeiden Sie es, Zahnzement um die Position der zweiten Kanüle aufzutragen.
- Lassen Sie den Zahnzement 2 - 3 Minuten trocknen, entfernen Sie dann den Halterarm von der ersten Kanüle und fixieren Sie die zweite Kanüle darin. Wiederholen Sie die Schritte 2.11 und 2.12. Setzen Sie eine Dummy-Kanüle auf beide Führungskanülen. Stellen Sie sicher, dass die Dummy- und die Führungskanüle die gleiche Länge haben, um eine Infiltration des Gewebes und eine Verstopfung der Kanüle zu verhindern.
- Führen Sie das freie Ende beider Katheter in die Tasche ein, die zuvor zwischen den Schulterblättern des Tieres angebracht wurde. Entfernen Sie die Klammern und nähen Sie die Haut mit einem Nahtfaden 4-0.
Anmerkung: Die obere Führungskanüle muss für bevorstehende Aβo-Infusionen zugänglich sein.
- Nehmen Sie das Tier aus dem stereotaktischen Rahmen und setzen Sie es wieder in seinen Käfig. Legen Sie den Käfig während der postoperativen Genesung auf eine wärmende Wasserdecke, bis das Tier aufwacht. Der Käfig sollte teilweise auf dem Pad liegen, damit die Ratte bei Bedarf der Hitze entkommen kann. Überwachen Sie das Tier ständig, bis es wieder genügend Bewusstsein erlangt, um die Brustbeinlage aufrecht zu erhalten.
- Bringen Sie die Ratten 10 Tage lang unter engmaschiger Überwachung in die Tiereinrichtung zurück, damit sie sich von der Operation erholen können.
Anmerkung: Geben Sie ein Tier, das operiert wurde, nicht an andere Tiere zurück, bis es sich vollständig erholt hat. Meloxicam (1 mg/kg) wird nach der Operation zwei Tage lang einmal täglich zur Schmerzbehandlung verabreicht.
>3. Installation der osmotischen Pumpe
- Osmotische Pumpen einen Tag vor der Installation mit 6E10-Antikörper (1 mg/ml; 100 μl) befüllen und IgG1-Antikörper (1 mg/ml; 100 μl) gemäß den Herstellerangaben unter sterilen Bedingungen kontrollieren. Bewahren Sie die Pumpen über Nacht in sterilem destilliertem Wasser bei 37 °C auf, um die Pumpen zu aktivieren.
- Betäuben Sie Ratten mit Isofluran 3%, um osmotische Pumpen zu installieren (0,5 μl/h für 7 Tage). Rasieren Sie sich zwischen den Schulterblättern und desinfizieren Sie die Haut mit einer Lösung aus Chlorhexidingluconat 2% und Isopropylalkohol 2%. Machen Sie einen Schnitt von 2 cm mit einem Skalpell zwischen den Schulterblättern, um die PE50-Katheter zu lokalisieren, die mit der Führungskanüle verbunden sind.
- Schneiden Sie das Ende der PE50-Katheter mit Zahnzement mit einem Skalpell ab. Schließen Sie die osmotischen Pumpen an die PE50-Katheter an und fügen Sie etwas Zahnzement an der Pumpe und dem Katheterübergang hinzu, um die Verbindung zu sichern.
- Die Haut mit einem Nahtfaden 4-0 fest vernähen. Setzen Sie das Tier wieder in seinen Käfig auf ein Heizwasserkissen. Beobachten Sie, wie das Tier schnell aus einer Isofluran-Anästhesie aufwacht (ca. 5 min).
Anmerkung: Die Operation dauert ca. 5 bis 10 Minuten.
>4. Aβo Infusionen bei wachen und sich frei bewegenden Ratten
- Bereiten Sie die Aβo-Lösung (0,2 μg/μl) vor. Lassen Sie Aβo vor der Infusion 1 Stunde lang bei Raumtemperatur dynamisch und spontan aggregieren.
- Setzen Sie zwei 10-μl-Spritzen auf eine Infusionspumpe. Füllen Sie die Spritzen mit 5 μl sterilem destilliertem Wasser. Schneiden Sie zwei PE50-Katheter mit einem Skalpell auf eine Länge von ca. 60 cm. Füllen Sie beide Katheter mit sterilem destilliertem Wasser mit 1-ml-Spritzen und 21G-Nadeln.
- Bewahren Sie die 1-ml-Spritzen an einem Ende des Katheters auf und verbinden Sie das andere Ende mit den Hamilton-Spritzen. Entfernen Sie die 1-ml-Spritzen und prüfen Sie, ob sich keine Luftblasen in den Kathetern befinden.
- Führen Sie die innere Kanüle am Ende der PE50-Katheter ein. Füllen Sie die innere Kanüle, die mit PE50-Kathetern verbunden ist, mit sterilem destilliertem Wasser bis zu 1 μl auf Hamilton-Spritzen. Erzeugen Sie eine Luftblase, indem Sie die Kolben auf bis zu 2 μl zurückziehen.
- Mischen Sie die Aβo-Lösung, indem Sie sie mit einer Spitze mit minimaler Adhärenz auf und ab pipettieren. Vermeiden Sie die Bildung von Blasen beim Mischen. Beide internen Kanülen werden mit 1,5 μl Aβo-Lösung gefüllt, indem die Kolben auf bis zu 3,5 μl zurückgezogen werden.
- Machen Sie Linien mit einem Marker vor und nach der Luftblase in beiden Kathetern. Dies dient als Kontrollpunkt für die laufende Infusion. Bringen Sie den Käfig für die Infusion in die Nähe der Infusionspumpe und entfernen Sie die Abdeckung.
- Setze die Ratte in eine Kuscheltasche und kratze den Arm des Kuscheltiers fest um ihren Hals, um den Kopf der Ratte bewegungsunfähig zu machen. Entfernen Sie die Dummy-Kanüle von den beiden Führungskanülen. Führen Sie die zuvor vorbereitete Innenkanüle in die Führungskanüle ein. Vergewissern Sie sich, dass sie vollständig eingeführt und gut an der Basis der Führungskanüle befestigt sind.
- Befreien Sie die Ratte aus dem Kuscheltier und setzen Sie sie wieder in ihren Käfig, um den Stress zu begrenzen. Überwachen Sie genau, um sicherzustellen, dass sich die Katheter nicht verdrehen und die Infusion korrekt durchgeführt wird.
- Schalten Sie die Infusionspumpe ein. Injizieren Sie 1 μl Aβo-Lösung mit einer Geschwindigkeit von 0,1 μl/min (10 min). Prüfen Sie während der Infusion, ob sich der Kolben der Spritze von 3,5 μl auf 2,5 μl bewegt und dass sich die Luftblase in beiden PE50-Kathetern kontinuierlich bewegt.
- Lassen Sie die innere Kanüle nach der Infusion weitere 5 Minuten an Ort und Stelle, um eine effiziente Diffusion der Aβo-Lösung zu ermöglichen. Bringen Sie die Ratte zurück in die Kuschelkuschel, um die innere Kanüle und die verschlossene Führungskanüle zu entfernen, um einen Rückfluss der injizierten Lösung zu verhindern. Verwenden Sie eine Dummy-Kanüle, die kurz vor dem Winkelarm der Kanüle stoppt. Bringen Sie das Tier in seinen Käfig zurück.
- Wiederholen Sie die Aβo-Infusion einmal täglich an 6 aufeinanderfolgenden Tagen. Euthanasiere das Tier durch Enthauptung.
