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>1. Herstellung und Funktionalisierung von kapazitiven Immunsonden
- Schneiden Sie ein 25 cm langes Stück Perfluoralkoxy (PFA)-beschichteten Platindraht ab (siehe Materialtabelle) und entfernen Sie mit einem Skalpell ca. 5 mm PFA-Beschichtung von einem Ende, wobei Sie darauf achten sollten, dass Sie nicht in den Platindraht schneiden.
- Führen Sie das abisolierte Ende des Platindrahtes in einen vergoldeten 1-mm-Steckerstift ein und crimpen Sie die Zähne des Steckerstifts mit einer Spitzzange um das abisolierte Ende des Platindrahtes (siehe Materialtabelle).
- Löten Sie den Platindraht an den vergoldeten Anschlussstift. Achten Sie darauf, nicht zu viel Lötzinn zu verwenden.
- Bereiten Sie die Dopaminlösung vor, indem Sie 50 mg Dopamin-HCl in 50 ml 10 mM phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, pH 6,0) unter Rühren auflösen.
- Sobald das Dopamin vollständig aufgelöst ist, legen Sie die Spitze des Platindrahts in das Gefäß, in dem sich das frisch hergestellte, mit Dopamin angereicherte PBS befindet. Stecken Sie einen goldenen Steckerstift in einen Kanal des Kopftisches (siehe Materialtabelle).
- Verbinden Sie die Scheibenelektrode aus Silberchlorid (AgCl) (Masseelektrode, siehe Materialtabelle) mit dem Massekanal im Kopftisch. Legen Sie die AgCl-Scheibe in das Gefäß, das mit Dopamin ergänztes PBS und Platindraht enthält. Achten Sie darauf, dass Sie nur die Scheibenelektrode und nicht eine Länge des Drahtes oder Lötmittels eintauchen. Schließen Sie einen Draht-Shunt an die Referenzkanäle des Kopftisches an, bevor Sie fortfahren.
- Öffnen Sie die interaktive Datenerfassungssoftware (siehe Materialtabelle). Bereiten Sie ein Sägezahn-Elektroabscheidungsbefehl Potentialprotokoll mit den folgenden Parametern vor: Startpotential = −0,6 V; Endpotential = +0,65 V; Abtastrate = 0,04 V∙s-1; Dauer der Abscheidung = 420 s. Starten Sie das Polydopamin-Abscheidungsprotokoll und stellen Sie sicher, dass alle Drähte richtig angeschlossen sind.
- Nach Abschluss der Polydopaminabscheidung das AgCl-gemahlene Pellet und die Spitze des Platindrahts aus dem Gefäß entfernen, wobei darauf zu achten ist, dass die Spitze der Platindrahtelektrode nicht beschädigt wird. Legen Sie die Spitze des Drahtes für 2-5 Minuten in ein Mikroröhrchen, das PBS (pH 7,4) enthält, während die Antikörperlösung vorbereitet wird. Stellen Sie sicher, dass die Drahtspitze nicht mit den Seiten oder der Unterseite des Mikroröhrchens in Berührung kommt.
HINWEIS: Antikörperlösung kann während der Polydopaminabscheidung hergestellt werden; Die Übertragung des Platindrahtes aus dem Dopamin-haltigen Gefäß in das Mikroröhrchen von PBS nach der Polydopamin-Ablagerung sollte jedoch nicht übersprungen werden.
- Bereiten Sie die Antikörperlösung vor. Kombinieren Sie den Antikörper von Interesse mit PBS (pH 7,4) im Verhältnis 1:20 in einem Gefäß geeigneter Größe (z. B. einem Mikroröhrchen).
HINWEIS: Der hier verwendete monoklonale Anti-Neuropeptid-Antikörper Y (Anti-NPY) (siehe Materialtabelle) wurde bei 1 mg/ml aliquotiert; Ein Beispiel für eine Antikörperzubereitung wäre hier 4 μl Antikörper zu 76 μl PBS.
- Die mit Polydopamin abgeschiedene Spitze der Platinelektrode mindestens 2 Stunden lang bei Raumtemperatur in Antikörperlösung einweichen, dabei erneut darauf achten, dass die Platindrahtspitze in Lösung aufgehängt ist und nicht auf der Innenfläche des Mikroröhrchens aufliegt.
HINWEIS: Die jüngste Implementierung dieser Technik hat die Verwendung der Platindrahtelektrode unmittelbar nach diesem Schritt begünstigt, anstatt sie für die spätere Verwendung nass oder trocken zu lagern.
- Spülen Sie nach dem Einweichen in der Antikörperlösung die neu funktionalisierte kapazitive Immunsonde (CI-Sonde) kurz in PBS (pH 7,4) aus. Die Sonde ist nun einsatzbereit.
>2. Versuchsaufbau für den in vitro Nachweis und die Messung von Peptiden
- Setzen Sie die Funktionsspitze der CI-Sonde in die Durchflusskammer ein und achten Sie darauf, die Spitze der Elektrode in keiner Weise zu stören, da dies die sensorische Spitze der Sonde beschädigen kann.
HINWEIS: Die Strömungskammer wurde durch Gießen von Silikonelastomer (siehe Materialtabelle) in eine 35-mm-Kulturschale mit einem länglichen eiförmigen Raumfüller in der Mitte der Schale erzeugt. Nach dem Aushärten wird die eiförmige Form vom Elastomer entfernt. Die Kammer wird dann mit Tris-gepufferter Kochsalzlösung (TBS) überfüttert und ermöglicht eine Flussrate von 3 mL/min. Stellen Sie sicher, dass der Zu- und Abfluss den Flüssigkeitsstand in der Kammer so aufrechterhält, dass keine Gezeitenwirkung des Superfusats beobachtet wird. Die Strömung muss so lange an Ort und Stelle bleiben, wie die CI-Sonde in Betrieb ist.
- Führen Sie vor dem ersten experimentellen Test einen TBS-Standardlauf durch, um die CI-Sonde zu konditionieren. Richten Sie das folgende Befehlsspannungsprotokoll ein: positives Schrittpotential = +100 mV; negatives Schrittpotential = −5 mV; Schrittlänge = 20 ms; Dauer des Erwerbs = 600 s.
HINWEIS: Es ist wichtig, die Äquilibrierung der Sonde in der Anfangsphase des Zyklus des Befehlspotenzials vor der Datenerfassung zu berücksichtigen.
- Erstellen Sie eine Lösung des interessierenden Peptids mit demselben TBS, um die Zusammensetzung des Superfusats beizubehalten. Richten Sie ein Verteilersystem ein, in dem das Superfusat zwischen TBS und peptidergänztem TBS umgeschaltet werden kann, ohne dass Blasen in das Schlauchsystem oder die Durchflusskammer gelangen.
HINWEIS: In der vorliegenden Studie wurde synthetisches Schweine-NPY-Peptid (siehe Materialtabelle) verwendet.
- Richten Sie das Peptid-Sensing-Datenerfassungsprotokoll unter Verwendung von TBS-Standardparametern ein (siehe Schritt 2.2.).
HINWEIS: In dieser Implementierung betrug die Dauer jedes experimentellen Tests 360 s (120 s TBS, 120 s peptid-supplementierte TBS, 120 s TBS).