>1. Vorbereitung vor der Beschriftung
- Vorbereitung und Pflege von primären Hippocampuskulturen
- Bereiten Sie primäre Hippocampuskulturen mit einer Dichte von 150.000 Zellen vor, die auf Poly-D-Lysin-beschichteten (0,1 mg/ml) 18-mm-Deckgläsern plattiert sind. Es stehen hervorragende Leitfäden für die Vorbereitung dissoziierter neuronaler Kulturen zur Verfügung.
Anmerkung: Bei Bedarf können die Kulturen mit Cytosin-Arabinosid (Ara-C, 10 μM ab Tagen in vitro 1 [DIV1]) behandelt werden, um eine Gliaproliferation in der Zubereitung zu vermeiden.
Anmerkung: Anstelle von Poly-D-Lysin können alternative Beschichtungsreagenzien wie Fibronektin (1 mg/ml) oder Laminin (5 μg/ml) verwendet werden.
- Halten Sie die Kulturen in einem Zellinkubator bei 37 °C und 5 % CO2 in 2 ml/Vertiefung neurobasaler Medien, die mit B27 und 2 mM L-Glutamin ergänzt sind.
Anmerkung: Auf Wunsch können Ersatzstoffe für L-Glutamin (z. B. Glutamax) verwendet werden.
- Entfernen Sie wöchentlich die Hälfte des Medienvolumens und ersetzen Sie es durch das gleiche Volumen an supplementierten neurobasalen Medien.
- OPTIONAL: Transfektion von mutierten und/oder epitopmarkierten Rezeptoren
HINWEIS: Neuronen sollten mindestens 3–4 Tage vor dem Analysezeitpunkt transfiziert werden, um die Rezeptorexpression zu ermöglichen. Die Verwendung junger Neuronen (DIV6–9) führt zu einer besseren Transfektionseffizienz als ältere (DIV15–20) Neuronen, aber eine ausreichende Anzahl transfizierter Zellen (>20) kann unabhängig vom verwendeten DIV erreicht werden.
- Für jede Vertiefung einer 12-Well-Platte werden 1,5 μg Plasmid, das das interessierende Konstrukt enthält, in 100 μl frischem neurobasalem Medium ohne B27- oder Glutamin-Supplementierung in einem Mikrozentrifugenröhrchen verdünnt und durch schnelles Vortexen gemischt.
Anmerkung: Für eine erfolgreiche Transfektion ist es entscheidend, dass das verwendete neurobasale Medium so frisch wie möglich ist, idealerweise weniger als 1 Woche nach dem Öffnen der Flasche.
- In einem zweiten Mikrozentrifugenröhrchen 1 μl eines geeigneten Lipofektionsreagenzes mit 100 μl frischem neurobasalem Medium mischen und vorsichtig mischen.
Anmerkung: Verwirbeln Sie die Lipofektionsreagenzmischung nicht. Die Verwendung frischer Lipofektionsreagenzien kann die Transfektionseffizienz verbessern.
- Inkubieren Sie die Röhrchen 5 Minuten lang bei Raumtemperatur (RT).
- Geben Sie die Lipofektionsreagenzmischung tropfenweise zur DNA-Mischung, mischen Sie sie vorsichtig und inkubieren Sie sie 20 Minuten lang bei RT.
- Passen Sie das Volumen des Mediums in jeder Vertiefung auf 1 ml konditioniertes Medium an.
- Geben Sie das Lipofektionsreagenz-DNA-Gemisch tropfenweise in die Vertiefung.
- Bringen Sie die Zellen in den Inkubator zurück und warten Sie mindestens 3–4 Tage für die Proteinexpression.
Anmerkung: Für die Zwecke der unten beschriebenen Internalisierungs- und Recyclingprotokolle wurden Hippocampus-Neuronen bei DIV11–12 mit Konstrukten transfiziert, die GluN2B exprimieren, die mit grün fluoreszierendem Protein (GFP) in der extrazellulären Domäne (GFP-GluN2B) markiert sind, und bei DIV15–16 abgebildet.
- OPTIONAL: Inkubation von Zellen mit Medikamenten (chronisch oder akut) in den konditionierten Medien bis zur Fixierung.
HINWEIS: Beginnen Sie bei der Akutbehandlung mit der Behandlung der Zellen, bevor Sie sie markieren. Abhängig vom verwendeten medikamentösen Behandlungsprotokoll können die Zellen in Abschnitt 2 in arzneimittelhaltigen Medien aufbewahrt werden. In unserem Beispiel wurden DIV21-Zellen einem chemisch induzierten Langzeitpotenzierungsprotokoll (cLTP) unterzogen, um den oberflächenexprimierten α-Amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolpropionsäurerezeptor (AMPAR) zu erhöhen.
- Tauschen Sie konditionierte Medien gegen extrazelluläre Lösung (ECS) aus.
- Behandeln Sie die Zellen mit 300 μM Glycin im ECS für 3 Minuten bei RT. Behandeln Sie als Kontrolle ein Schwesterdeckglas mit ECS (ohne Glycin).
- Waschen Sie die Zellen 3x mit 37 °C ECS und stellen Sie die Zellen im ECS (ohne Glycin) für 20 min in den Zellinkubator, bevor Sie mit Abschnitt 2.
fortfahren
HINWEIS: ECS (in mM): 150 NaCl, 2 CaCl2, 5 KCl, 10 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethensulfonsäure (HEPES), 30 Glucose, 0,001 Tetrodotoxin (TTX), 0,01 Strychnin und 0,03 Picrotoxin bei pH 7,4.
>2. Live-Markierung von oberflächenexprimierten Rezeptoren
- Deckgläser für die Beschriftung vorbereiten
- Um Reagenzien zu sparen und die Manipulation zu erleichtern, übertragen Sie Deckgläser mit der Zellseite nach oben auf eine mit Paraffinfolie bedeckte Schale.
HINWEIS: Es ist wichtig, die Proben niemals austrocknen zu lassen.
- Bewahren und pflegen Sie konditionierte Medien bei 37 °C für Inkubations- und Waschschritte.
Anmerkung: Für ein Deckglas von 18 mm wird eine Inkubation mit 75–100 μl Medium für die Antikörpermarkierung und 120–150 μl für die Internalisierung/das Recycling empfohlen.
- Markierung von Oberflächenrezeptoren mit primären Antikörpern
- Inkubieren Sie Zellen mit Primärantikörpern, verdünnt in konditionierten Medien für 15 min bei RT.
Anmerkung: Für GFP-markierte Rezeptoren wurde Kaninchen-Anti-GFP-Antikörper in einer Verdünnung von 1:1000 verwendet. Für endogenes GluA1 wurde Maus-Anti-GluA1 in einer Verdünnung von 1:200 verwendet.
- Das antikörperhaltige Medium wird vorsichtig mit einer Vakuumpipette abgesaugt und die Zellen dreimal mit konditionierten Medien gewaschen
Anmerkung: Wenn keine konditionierten Medien verfügbar sind, können alle Waschschritte mit PBS+ [phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) mit 1 mM MgCl2 und 0,1 mM CaCl2] durchgeführt werden. Eine manuelle Aspiration mit einer Mikropipette kann durchgeführt werden, wenn eine sanfte Vakuumaspiration nicht verfügbar ist.
>3. Oberflächenausdruck (Abbildung 1)
- Sekundäre Antikörpermarkierung von oberflächenexprimierten Rezeptoren
- Einmal mit PBS+ waschen.
- Fixieren Sie die Zellen durch Inkubation mit 4 % Paraformaldehyd (PFA) und 4 % Saccharose in PBS für 7–8 min.
Anmerkung: Im Gegensatz zu anderen Fixierungsmethoden, wie z. B. der Methanol-Inkubation, permeabilisiert PFA die Plasmamembran nicht und eignet sich daher für die Oberflächenexpressionsanalyse. Für ein optimales Ergebnis verwenden Sie frisch zubereitetes PFA. Eine kurzfristige Lagerung von PFA bei 4 °C oder eine langfristige Lagerung (bis zu 30 Tage) bei -20 °C ist für eine adäquate Fixierung zulässig.
Vorsicht: PFA ist ein bekanntes Karzinogen. Verwenden Sie bei der Handhabung die richtige persönliche Schutzausrüstung und eine Sicherheitshaube.
- Waschen Sie die Zellen dreimal mit regulärem PBS.
Anmerkung: Alternativ können 0,1 M Glycin zum Waschen von PFA anstelle von PBS verwendet werden, da Glycin jedes verbleibende Fixiermittel löscht, das den Hintergrund in der Zubereitung erhöhen kann.
- Blockieren Sie unspezifische Bindungsstellen, indem Sie 30 Minuten lang bei RT.
mit 10 % normalem Ziegenserum (NGS) in PBS inkubieren.
Anmerkung: Die Blockierzeit kann verlängert werden, ohne dass sich dies negativ auf die Markierung auswirkt.
- Inkubieren Sie mit fluoreszenzmarkierten Sekundärantikörpern, verdünnt in 3 % NGS in PBS für 1 h bei RT, um primäre Antikörper-markierte Rezeptoren (d. h. oberflächenexprimiert) zu markieren.
Anmerkung: In diesen Beispielen wurde eine Verdünnung von Alexa 555-konjugierten Sekundärantikörpern im Verhältnis 1:500 verwendet: Ziegen-Anti-Kaninchen für GFP-markierte Rezeptoren und Ziegen-Anti-Maus für GluA1.
- Waschzellen mit PBS 3x.
- Markierung intrazellulärer Rezeptoren
- Permeabilisieren Sie Zellen mit 0,25 % Triton X-100 in PBS für 5–10 min bei RT.
Anmerkung: Um zu überprüfen, ob die erste Runde der Antikörpermarkierung alle Oberflächenepitope belegt, kann dieser Permeabilisierungsschritt in einer Schwesterkultur übersprungen werden. In diesem Fall sollte kein Signal für intrazelluläre Rezeptoren erhalten werden. Um zu überprüfen, ob im vorherigen Abschnitt 2 keine internen Rezeptoren markiert wurden (d. h. die Integrität der Plasmamembranen in der Kultur gezeigt wird), kann der Permeabilisierungsschritt in einer Schwesterkultur übersprungen werden, und ein primärer Antikörper gegen ein intrazelluläres Protein (z. B. postsynaptisches Dichteprotein 95 [PSD-95] oder Mikrotubuli-assoziiertes Protein 2 [MAP2]) kann in Schritt 2.2.1 verwendet werden. Unter diesen Bedingungen sollte kein Signal von dieser Primärseite empfangen werden. In diesem Fall wurde ein Kaninchen-Anti-PSD-95-Antikörper (1:500) verwendet.
- Blocken Sie mit 10% NGS in PBS für 30 Minuten bei RT.
- Markieren Sie intrazelluläre Rezeptoren durch Inkubation permeabilisierter Zellen mit demselben Primärantikörper, der in Abschnitt 2.2 verwendet wurde, verdünnt in 3 % NGS in PBS für 1 h bei RT.
Anmerkung: Die Antikörperverdünnung für die Markierung intrazellulärer Rezeptoren kann sich von der für die Markierung oberflächenexprimierter Rezeptoren erforderlichen Verdünnung unterscheiden. Am Beispiel von GluA1 wurde die gleiche Antikörperverdünnung (1:200) verwendet.
- Waschen Sie die Zellen 3x mit PBS.
- Markierung mit zweitem, fluoreszenzmarkiertem Sekundärantikörper, verdünnt in 3 % NGS in PBS für 1 h bei RT.
Anmerkung: In diesen Beispielen wurde eine Verdünnung von 1:500 des Anti-Maus-Antikörpers Alexa 647 (für GluA1) verwendet.
- Waschen Sie die Zellen 3x mit PBS.
>4. Internalisierung (Abbildung 2)
- Internalisierung von Antikörper-markierten Oberflächenrezeptoren
- Nach der Markierung von oberflächenexprimierten Rezeptoren und dem Waschen von Antikörpern (Abschnitt 2.2) werden die Zellen in konditionierten Medien ohne Antikörper aufbewahrt und in den Inkubator (37 °C) zurückgeführt, um eine Internalisierung zu ermöglichen.
HINWEIS: Für N-Methyl-D-Aspartat (NMDA)-Rezeptoren wird eine Internalisierung von 30 Minuten empfohlen. Als Kontrolle kann eine Schwesterkultur mit konditionierten Medien bei 4 °C während des Internalisierungsprozesses aufrechterhalten werden. Unter diesen Bedingungen sollte eine minimale Rezeptorinternalisierung erfolgen.
- Markierung von Oberflächenrezeptoren
- Waschen Sie die Zellen einmal mit PBS+.
- Fixieren Sie Zellen mit 4 % PFA und 4 % Saccharose in PBS für 7–8 min.
Vorsicht: Verwenden Sie beim Umgang mit PFA geeignete persönliche Schutzausrüstung und eine Sicherheitshaube.
- Waschen Sie die Zellen 3x mit regulärem PBS.
- Blockieren Sie mit 10 % NGS in PBS für 30 Minuten bei RT, um eine unspezifische Bindung zu verhindern.
- Inkubieren Sie Proben mit fluoreszenzmarkierten Sekundärantikörpern, verdünnt in 3 % NGS in PBS für 1 h bei RT, um primäre Antikörper-markierte Rezeptoren (d. h. oberflächenexprimierte Rezeptoren, die nicht internalisiert wurden) zu markieren.
Anmerkung: In diesem Beispiel wurde der Alexa 555-konjugierte Ziegen-Anti-Kaninchen-Sekundärantikörper (1:500) für die Markierung verwendet.
- Waschen Sie die Zellen 3x mit PBS.
- Markierung internalisierter Rezeptoren
- Permeabilisieren Sie Zellen mit 0,25 % Triton X-100 in PBS für 5–10 Minuten.
- Blockieren Sie die unspezifische Bindung durch Inkubation mit 10% NGS in PBS für 30 min bei RT.
- Inkubieren Sie Proben mit fluoreszenzmarkierten Sekundärantikörpern, verdünnt in 3 % NGS in PBS für 1 h bei RT, um internalisierte Antikörper-markierte Rezeptoren zu markieren.
Anmerkung: In diesem Beispiel wird der Alexa 647-konjugierte Ziegen-Anti-Kaninchen-Sekundärantikörper (1:500) für die Markierung verwendet.
- Waschen Sie die Zellen 3x mit PBS.
>5. Recycling (Abbildung 3)
- Internalisierung von Antikörper-markierten Oberflächenrezeptoren
- Nach der Markierung von oberflächenexprimierten Rezeptoren und dem Waschen von Antikörpern (Abschnitt 2.2) werden die Zellen in konditionierten Medien ohne Antikörper aufbewahrt und in den Inkubator (37 °C) zurückgeführt, um eine Internalisierung zu ermöglichen.
HINWEIS: Für NMDA-Rezeptoren wird eine Internalisierung von 30 Minuten empfohlen.
- Blockierung von stabilen, oberflächenexprimierten Rezeptoren
- Um die Epitope auf dem primären Antikörper zu blockieren, die an oberflächenexprimierte Rezeptoren gebunden sind, die nicht internalisiert wurden, inkubieren Sie Zellen mit unkonjugierten Fab Anti-IgG (H+L)-Antikörperfragmenten (gegen den in Abschnitt 2.2 verwendeten primären), verdünnt in konditionierten Medien (20 μg/ml) für 20 min bei RT. Diese Behandlung verhindert eine zukünftige Wechselwirkung mit Sekundärantikörpern.
Anmerkung: Für dieses Beispiel wurden Ziegen-Anti-Kaninchen-Fab-Fragmente verwendet.
Anmerkung: Kontrollexperiment: Um sicherzustellen, dass eine vollständige Blockierung der oberflächenexprimierten Rezeptoren stattgefunden hat, können Schwester-Deckgläser mit und ohne Fab inkubiert werden. Die Kulturen sollten unmittelbar nach der Fab-Behandlung fixiert werden, und beide Kulturen werden mit einem Alexa 555-konjugierten Sekundärantikörper inkubiert. Kein Alexa 555-Signal in den Fab-inkubierten Zellen deutet auf eine ordnungsgemäße Antikörperblockierung hin.
- Waschen Sie die Zellen 3x mit konditionierten Medien.
- Inkubieren Sie Zellen mit konditionierten Medien, die 80 μM Dynasore enthalten, um eine weitere Internalisierung zu verhindern, und bringen Sie die Zellen in den Inkubator (37 °C) zurück, um das Recycling internalisierter Rezeptoren zu ermöglichen. Dynasore ist ein GTPase-Hemmer, der Dynamin hemmt und somit die Internalisierung verhindert.
HINWEIS: Es wird eine Zeit von 45 Minuten für das NMDAR-Recycling empfohlen. Beachten Sie, dass Dynasore ausschließlich den Dynamin-abhängigen Internalisierungsprozess blockiert (z. B. die Internalisierung von NMDARs). Die Internalisierung anderer synaptischer Proteine (Dynamin-unabhängig) kann jedoch auch in Gegenwart von Dynasore auftreten.
- Markierung von recycelten Rezeptoren
- Waschen Sie die Zellen einmal mit PBS+.
- Fixieren Sie Zellen mit 4 % PFA und 4 % Saccharose in PBS für 7–8 min.
Vorsicht: Verwenden Sie beim Umgang mit PFA geeignete persönliche Schutzausrüstung und eine Sicherheitshaube.
- Waschen Sie die Zellen 3x mit PBS.
- Blockieren Sie mit 10 % NGS in PBS für 30 Minuten bei RT, um eine unspezifische Bindung zu verhindern.
- Markieren Sie Zellen mit dem ersten fluoreszenzmarkierten Sekundärantikörper, verdünnt in 3% NGS in PBS für 1 h bei RT.
Anmerkung: In diesem Beispiel wurde ein Alexa 555-konjugierter Ziegen-Anti-Kaninchen-Antikörper (1:500) für die Markierung verwendet.
- Waschzellen 3x mit PBS.
Anmerkung: Längere Wäschen mit PBS (5–10 Minuten) können helfen, den Hintergrund in der Zubereitung zu reduzieren.
- Markierung internalisierter Rezeptoren
- Permeabilisieren Sie Zellen mit 0,25 % Triton X-100 in PBS für 5–10 Minuten.
- Blocken Sie mit 10% NGS in PBS für 30 Minuten bei RT.
- Markierung mit zweitem, fluoreszenzmarkiertem Sekundärantikörper, verdünnt in 3 % NGS in PBS für 1 h bei RT.
Anmerkung: In diesem Beispiel wurde ein Alexa 647-konjugierter Ziegen-Anti-Kaninchen-Antikörper (1:500) für die Markierung verwendet.
- Waschen Sie die Zellen 3x mit PBS.
>6. Einbetten und Abbilden von Proben
- Montieren Sie die Zellen, indem Sie die Deckgläser vorsichtig mit der Zellseite nach unten auf 12–15 μl des entsprechenden Eindeckmediums legen.
Anmerkung: Das Ansaugen von überschüssigem Einhängemedium verbessert die Bildqualität.
- Bilden Sie Zellen mit einem geeigneten konfokalen Mikroskop ab.
Anmerkung: Es wird empfohlen, einen Z-Stack in 60-facher Vergrößerung in Schritten von 0,35 μm abzubilden, der die gesamte Dicke des Neurons umfasst.
>7. Zeitliche Überlegungen
- Dies ist ein langes Protokoll, das an mehreren Stellen gestoppt werden kann. Falls gewünscht, über Nacht bei 4 °C in einer Feuchtkammer Blockierungs- und Primärantikörper-Inkubationsschritte durchführen.
- Alternativ können Sie bei Bedarf einen Mikrowellen-Gewebeprozessor verwenden, um die Inkubationszeiten nach der Fixation erheblich zu verkürzen. Verwenden Sie für alle Stufen 150 W bei 30 °C für die "On"-Einstellungen.
- Um zu blockieren, führen Sie den Prozessor mit 2 Minuten "Ein", 1 Minute "Aus" und 2 Minuten "Ein" aus.
- Führen Sie den Prozessor für die Inkubation von primären und sekundären Antikörpern bei 3 Minuten "Ein", 2 Minuten "Aus" und 3 Minuten "Ein" aus."
HINWEIS: Wir stellen keinen Qualitätsunterschied fest, wenn wir die oben genannten Änderungen am Protokoll vornehmen.
>8. Bildanalyse
- Es wird empfohlen, für die Bildanalyse FIJI zu verwenden, da es mit mehreren Dateiformaten kompatibel ist. Für unsere Daten wurden Bilder im Nikon ND2-Dateiformat aufgenommen.
- Ein Makroskript ermöglicht die einfache Batch-Quantifizierung verschiedener Parameter, die von FIJI vorausgewählt wurden. Die folgenden Schritte sind im Makro enthalten:
HINWEIS: Für diese Beispiele wurde die "integrierte Intensität" gemessen.
- Öffnen Sie die Bilddateien in FIJI und trennen Sie die Kanäle.
- Projizieren Sie jeden Kanalstapel als Projektion mit maximaler Intensität.
- Legen Sie für jeden Kanal einen niedrigeren Schwellenwert fest.
HINWEIS: Die Schwellenwerte sollten für jeden experimentellen Datensatz empirisch bestimmt werden. Obwohl jeder Kanal einen separaten unteren Schwellenwert haben kann, ist es entscheidend, dass die Kanalschwellenwerte für alle Bilder desselben Datensatzes konsistent eingehalten werden.
- Wählen Sie drei bis fünf sekundäre oder tertiäre Dendriten aus und speichern Sie sie als Regionen von Interesse (ROIs).
- Messen Sie die integrierte Dichte jedes ROI in Oberflächen- und intrazellulären Kanälen.
- Normalisieren Sie das Signal für jeden ROI, indem Sie den integrierten Dichtewert des Oberflächenkanals durch den intrazellulären Kanal dividieren.
- Wiederholen Sie die Messungen für alle Kontroll- und Versuchsbilder und normalisieren Sie die Versuchswerte auf Kontrollwerte (z. B. GluN2B WT oder No-Glycin-Bedingungen).
