Alle Verfahren, die die Probenentnahme beinhalten, wurden in Übereinstimmung mit den IRB-Richtlinien des Instituts durchgeführt.
>1. Vorbereitung der Ziel-Mikrosphäre
- Wählen Sie ein relevantes Zielantigen aus.
Anmerkung: In diesem Beispiel wurde das rekombinante Protein V1V2-2F5K verwendet, das so konzipiert wurde, dass es die trimere Spitze der nativen HIV-Hülle nachahmt.
- Führen Sie die Biotinylierung mit einem handelsüblichen Kit (Table of Materials) gemäß dem Protokoll des Herstellers durch.
- Berechnen Sie mmol des Biotin-Reagenzes, das zur Reaktion hinzugefügt werden soll, um einen 5-fachen molaren Überschuss zu erhalten, indem Sie die Formel verwenden: mmol Biotin = ml Protein x (mg Protein/mL Protein) x (mmol Biotin/mg Protein) x (5 mmol Biotin/mmol Protein). Berechnen Sie dann μl des hinzuzufügenden Biotin-Reagenzes nach folgender Formel: μL Biotin = mmol Biotin x (1.000.000 μl/L) x (L/10 mmol).
- Biotin vor dem Öffnen auf Raumtemperatur äquilibrieren. Lösen Sie das Protein in 0,5-2,0 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gemäß der obigen Berechnung auf.
- Bereiten Sie eine 10 mM Lösung des Biotin-Reagenzes in Dimethylsulfoxid (DMSO) vor und fügen Sie der Proteinlösung das entsprechende Volumen von 10 mM Biotin-Reagenz hinzu und inkubieren Sie die Reaktion 2 h lang auf Eis oder 30 min bei Raumtemperatur.
- Entfernen Sie überschüssiges Biotin mit Proteinkonzentratoren (Polyethersulfon [PES]-Membranen, 3 kDa Molekulargewichts-Cut-off [MWCO], 0,5 ml; Tabelle der Materialien) gemäß den Anweisungen des Herstellers.
- Geben Sie die Probe in die obere Kammer der Spin-Säule und fügen Sie PBS bis zu 400 μl hinzu. Kappe, dann setzen Sie diese Probenkammer in ein Sammelröhrchen ein. Zentrifugieren Sie bei 12.000 x g bei Raumtemperatur für 30 min.
- Verwerfen Sie den Durchfluss und fügen Sie PBS zu 400 μl hinzu. Wiederholen Sie die Zentrifugation. Verwerfen Sie den Durchfluss und fügen Sie PBS zu 100 μl hinzu. Messen Sie die Proteinkonzentration mit einem Spektralphotometer.
Anmerkung: Protein kann aliquotiert und bis zur Verwendung bei -80 °C eingefroren werden.
>2. Vorbereitung von Assayplatten für Antikörper-abhängige zelluläre Phagozytose (ADCP)
- Konjugieren von biotinyliertem Protein mit 1 μm Mikrosphären ("Kügelchen"; Tabelle der Materialien) gemäß den Anweisungen des Herstellers.
- Pro Platte mit konjugierten Kügelchen werden 6 μg Protein mit 12 μl Stammkügelchen in 200 μl 0,1 % Rinderserumalbumin (BSA)-PBS bei Raumtemperatur 1 h lang inkubiert, wobei alle 20 Minuten eine sanfte Vortexung durchgeführt wird.
- Bei 13.000 x g für 5 min zentrifugieren. Überstand verwerfen, vorsichtig vortexen und in 1200 μl 0,1 % BSA-PBS resuspendieren. Wiederholen Sie den Schleuder- und Waschschritt 2x. Resuspendieren Sie in 1200 μl 0,1 % BSA-PBS.
- Aliquotieren Sie 10 μl Bead-Lösung pro Vertiefung in einer 96-Well-Platte mit rundem Boden. Bereiten Sie Verdünnungen von Antikörpern oder Immunseren von Interesse in 12 μl 2 % HSA HBSS vor, in der Regel beginnend mit 50 μg/ml Antikörper oder einer Serumverdünnung von 1/100.
Anmerkung: In den Probendaten wurde der monoklonale Antikörper (mAb) 830A verwendet.
- Geben Sie 10 μl titrierte Antikörper/Seren in die Bead-Platte und inkubieren Sie sie 2 Stunden lang bei 37 °C. Geben Sie 200 μl 2 % HSA HBSS in jede Vertiefung und zentrifugieren Sie die Platte bei 2.000 x g für 10 Minuten.
- Entfernen Sie den Überstand vorsichtig durch schnelles Umkippen und Umfüllen der Flüssigkeit aus den Plattenvertiefungen in eine Spüle, um eine Störung des unsichtbaren Perlenpellets zu vermeiden.
>3. Isolierung von Muttermilchzellen
- Gewinnung von menschlicher Muttermilch von gesunden stillenden Frauen, ausgedrückt mit doppelten elektronischen oder manuellen Pumpen. Isolieren Sie die Zellen innerhalb von ~4 h nach der Expression und halten Sie die Milch bei Raumtemperatur.
- 50 ml Milch mit 50 mL Röhrchen bei 800 x g für 15 min zentrifugieren. Magermilch und Fett vorsichtig abgießen, dabei das Küvettenpellet ungestört lassen. Wischen Sie das Innere der Tube mit einem fusselfreien Tuch ab, um sämtliches Fett von der Tubenwand zu entfernen.
- Geben Sie 10 ml 2% Humanserumalbumin in Hanks ausgewogene Salzlösung (2% HSA HBSS [ohne Ca2+ oder Mg+]). Resuspendieren Sie das Pellet durch sanftes Pipettieren, um eine Zellaktivierung und Apoptose zu vermeiden. In ein 15 mL Röhrchen umfüllen und 10 min bei 450 x g zentrifugieren.
- Überstand abgießen und Schritt 1.3 wiederholen. Dann resuspendieren Sie die Zellen vorsichtig in 1-2 ml 2 % HSA HBSS, abhängig von der erwarteten Zellzahl, und zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer oder einem automatisierten Zellzähler, wobei auch die Lebensfähigkeit der Zellen zu beachten ist.
>4. ADCP-Assay
HINWEIS: Die hier beschriebenen Methoden wurden von Ackerman et al. übernommen.
- Geben Sie 50.000 frisch isolierte BM-Zellen in jede Vertiefung der ADCP-Assay-Platte in 200 μl 2 % HSA-HBSS. 2 h bei 37 °C inkubieren.
- Für Kontrollexperimente inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C mit 10 μg/ml Aktininhibitor (Cytochalasin-D), 50 μg/ml Fc-Rezeptorblocker (FcBlock) oder einer Kombination aus beiden, bevor sie auf die Platten gegeben werden.
- Zentrifugierte Platte bei 930 x g für 10 min. 200 μl 2% HSA HBSS zugeben und die Zentrifugation wiederholen. Überstand wie in Schritt 2.7 vorsichtig entfernen und den Waschgang wiederholen.
- Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und färben Sie die Zellen auf Lebensfähigkeit mit 0,5 μg/ml (Endkonzentration) fixierbarem Viabilitätsfleck 450 pro Well in 50 μl 2 % HSA HBSS. 20 min bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren. Die Platte bei 930 x g 10 min zentrifugieren und den Überstand wie in Schritt 2.7 entfernen. 200 μl 2 % HSA HBSS zugeben und die Platte erneut zentrifugieren, gefolgt von der Entfernung des Überstands wie in Schritt 2.7.
- Nach der Viabilitätsfärbung werden die Zellen auf Leukozytenmarker von Interesse gefärbt, wobei mindestens eine CD45-spezifische Färbung wie PE-Maus anti-humanes CD45 (Klon HI30) in einer optimierten Konzentration (1 μg/μL in 50 μL 1% BSA HBSS in den Beispieldaten) enthalten ist.
Anmerkung: Alle abstammungsspezifischen Marker von Interesse können einbezogen werden.
- 20 min bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren. Die Platte bei 930 x g 10 min zentrifugieren und den Überstand wie in Schritt 2.7 entfernen. 200 μl 1 % BSA HBSS zugeben und die Zentrifugation wiederholen. Überstand entfernen. Die Zellen werden in 200 μl 0,5 % Formaldehyd 30 Minuten lang bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 °C im Dunkeln fixiert. Bis zur Analyse im Dunkeln kühl gestellt.
>5. Analyse durch Durchflusszytometrie
- Führen Sie ein anfängliches Gating durch, um Dubletten in einem Diagramm mit Vorwärtsstreuung (FSC) vs. Seitenstreuung (SSC) und Ablagerungen (Material kleiner als FSC = 5000) zu eliminieren (siehe Abbildung 1). Verwenden Sie ein Diagramm von SSC vs. Viabilitätsfärbung (in diesem Fall V450), um abgestorbene Zellen (diejenigen, die positiv für die Viabilitätsfärbung sind) zu entfernen.
- Verwenden Sie ein SSC- vs. CD45-Diagramm, um die wichtigsten Leukozytenklassen (Granulozyten, Monozyten, Lymphozyten) zu unterscheiden, wie ausführlich beschrieben.
Anmerkung: Diese Klassifizierung ist nur suggestiv und es werden linienspezifische Marker benötigt, um den Zelltyp zu bestätigen.
- Messen Sie die ADCP-Aktivität für alle CD45+-Zellen oder für jede interessierende Leukozyten-Untergruppe durch Gating mit einem Marker auf den bead-positiven Zellen in einem Histogramm des Fluorescein-Isothiocyanat-Kanals (FITC), in dem die fluoreszierenden Kügelchen nachgewiesen werden.
Anmerkung: Die Negativkontrollvertiefungen, in denen keine Kügelchen hinzugefügt wurden, zeigen an, wo die perlenpositiven Zellen im Histogramm sichtbar sind und wo daher der Gating-Marker platziert werden muss.
- Berechnen Sie die ADCP-Scores wie folgt auf: (Mediane Fluoreszenzintensität [MFI] der bead-positiven Zellen) x (% der gesamten CD45+-Zellen in der positiven Population). Verwenden Sie eine Grafiksoftware, um die Werte bei jeder Ab-/Serumkonzentration darzustellen und eine Flächen-unter-der-Kurve-Analyse (AUC) durchzuführen.
Anmerkung: ADCP gilt als positiv, wenn die AUC größer als das 3-fache der Standardabweichung der AUC des ADCP-Scores eines unspezifischen negativen Kontroll-mAb (in diesem Fall 3865) ist.
