Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. Präparation von Immunzellen aus der Milz der Maus
HINWEIS: Euthanasiere naive Mäuse mit Kohlendioxid (CO 2) Euthanasie. C57BL/6-Mäuse, die von Jackson Laboratories gekauft und im eigenen Haus gezüchtet wurden, werden im Alter von 6 bis 12 Wochen für Experimente verwendet. Für Experimente werden sowohl männliche als auch weibliche Mäuse verwendet.
- Desinfizieren Sie die Maushaut mit 70 % Ethanol, um die Möglichkeit zu verringern, dass externe Verunreinigungen in die Probe gelangen.
- Präpariere die Milz der Maus mit Präparierwerkzeugen, chirurgischen Scheren und Zangen. Entnehmen Sie die Milz und legen Sie die abgelöste Milz in ein konisches 50-ml-Röhrchen mit ~5 mL kompletter Medien des Roswell Park Memorial Institute (cRPMI) auf Eis.
Anmerkung: Der vollständige RPMI besteht aus 10 % fötalem Rinderserum (FBS), 2 mM L-Glutamin und 1 % Penicillin/Streptomycin.
- Um die Milz der Maus zu entnehmen, machen Sie mit einer Schere einen 5 cm langen Schnitt in das Fell und die Haut entlang der linken Seite der Maus auf halbem Weg zwischen den Vorder- und Hinterbeinen. Öffnen Sie die Körperhöhle ~5 cm und entfernen Sie die Milz mit einer Pinzette. Die Milz hat die Farbe einer Kidneybohne und ist länger und flacher als die benachbarte Niere.
- Gießen Sie den Inhalt von Schritt 1.2 auf einen sterilen 70-μm-Filter, der an einem neuen konischen 50-ml-Röhrchen befestigt ist. Trennen Sie die Milz mechanisch in eine einzellige Suspension, indem Sie die Milz mit einem 5-ml-Spritzenkolben durch den Filter drücken, bis keine Milzpulpe mehr auf der Filteroberfläche verbleibt.
- Pelletieren Sie die Splenozyten mit einer Ausschwingrotor-Arbeitsplattenzentrifuge bei 500 x g für 5 min bei 4 °C.
- Den Überstand vorsichtig dekantieren. Die pelletierten Splenozyten verbleiben am Boden des konischen 50-ml-Röhrchens.
- Um rote Blutkörperchen zu entfernen, suspendieren Sie die pelletierten Splenozyten erneut in 1 ml Ammoniumchlorid-Kalium (ACK)-Lysepuffer für 3 Minuten gemäß den Anweisungen des Herstellers. Gut mischen.
- Quenden Sie den ACK-Lysepuffer mit 15 mL cRPMI.
- Pelletieren Sie die Lymphozyten wie in Schritt 1.4 beschrieben.
- Suspendieren Sie die Zellsuspension in 5 mL cRPMI in einem konischen 50-ml-Röhrchen. Legen Sie die Proben auf Eis.
- Um die Zellen zu zählen, geben Sie 10 μl der Zellsuspension in ein 0,6-ml-Mikrozentrifugenröhrchen und verdünnen Sie sie im Verhältnis 1:1 mit Trypanblau-Lösung. Dann auf ein Hämozytometer oder ein automatisiertes Zellzählsystem übertragen.
- Nach der Zählung werden die Zellen in Abhängigkeit von der Zellkonzentration in Zellsuspension wie in Schritt 1.9 in einer Tischzentrifuge bei 500 x g bei 4 °C 5 Minuten lang pelletiert, um die Zugabe von cRMPI-Medien vorzubereiten, die den Indo-1 AM-Esterfarbstoff enthalten.
- Berechnen Sie das Volumen für die Re-Suspension der Zellen, um 10-12 x 106 Zellen/ml zu erreichen. Dabei handelt es sich um eine 2-fache Konzentration der erforderlichen Gesamtzellzahl.
- Suspendieren Sie die Zellen erneut in dem in Schritt 1.11 berechneten cRPMI-Volumen. Die Zellen werden bei 37 °C mit 5 % CO2 in ein konisches 50-ml-Röhrchen mit belüftetem Deckel oder eine Gewebekulturplatte gegeben.
>2. Markierung von Indo-1 ratiometrischen Farbstoffen und fluoreszierenden Antikörpern
- Geben Sie gemäß den Anweisungen des Herstellers 50 μl Dimethylsulfoxid (DMSO) in eine Durchstechflasche mit 50 μg Indo-1 AM. Die Konzentration der Stammlösung beträgt 1 μg/μL.
Anmerkung: DMSO wird in Mikrofläschchen mit dem Kit geliefert, um eine Oxidation von DMSO zu verhindern.
- Das Stammaliquot (1 μg/μl) wird in das entsprechende Versuchsvolumen (gemäß Nummer 1.11) von cRPMI in einer Konzentration von 6 μg/ml, einer 2-fachen Konzentration, verdünnt. Indo-1 darf nicht in wässriger Lösung gelagert werden.
Anmerkung: Andere Puffer mit zugesetztem Kalzium können je nach Zellbedarf verwendet werden.
- Das gesamte Medium mit Indo-1 in ein Wasserbad bei 37 °C stellen.
Anmerkung: Es ist die Mindestkonzentration von Indo-1 AM-Ester zu verwenden, die erforderlich ist, um ein angemessenes Signal zu erhalten. Dies muss für unterschiedliche Zelltypen titriert werden. In der Regel ist eine Konzentration zwischen 3-5 μM ausreichend. Bei primären T-Zellen erhöht das Beladen von Zellen mit Indo-1 in einer Konzentration >5 μg/ml die mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) über einem log von 6 auf spektralen Durchflusszytometern. In diesem Fall verringern Sie die Intensität des ultravioletten (UV) Lasers und titrieren Sie Indo-1 auf eine niedrigere Konzentration.
- Die zuvor hergestellte Zellsuspension (in Schritt 1.12) wird 1:1 in cRPMI verdünnt, einschließlich der in Schritt 2.2 hergestellten 2x Indo-1-Medien. Stellen Sie sicher, dass die Zellen eine Konzentration zwischen 5-6 x 106/ml haben.
Anmerkung: Färben Sie ungefärbte Einzelfleckenkontrollen oder Oberflächenmarkierungs-Einzelfleckenzellenkontrollen nicht mit Indo-1. Durch die Zugabe von Indo-1 zu Einzelfärbe-Antikörperkontrollen entsteht eine mehrfarbige Probe, da Indo-1 zu einfach gefärbten Zellen hinzugefügt wird. Die in Schritt 2.6 erstellte Probenplatte wird mit Indo-1 (calciumfreier) Ethylenglykoltetraessigsäure (EGTA) zusätzlich kontrolliert .
- 1 ml Zellen/Vertiefung/Versuchsbedingung in eine 12-Well-Gewebekulturplatte geben.
- Erstellen Sie eine einzelne gefärbte Kontrolle für Indo-1 (kalziumfreie) Probe unter Verwendung von zuvor indo-1 farbstoffbeladenen Zellen und fügen Sie EGTA bis zu einer Endkonzentration von 2 mM hinzu. EGTA chelatisiert Calcium in der Zellsuspension, wodurch eine sauberere Kontrollprobe entsteht.
- Erstellen Sie eine Indo-1-Positivkontrolle (Indo-1-Calcium-gebunden), indem Sie 50 μM Ionomycin zu der mit Farbstoffen beladenen Zellsuspension am Durchflusszytometer hinzufügen. Ionomycin ist ein membrandurchlässiges Calcium-Ionophor, das Calcium-Ionen bindet und den Transfer von Calcium-Ionen in die Zellen erleichtert.
- Erstellen Sie eine Vertiefung für die biologische Negativkontrolle ohne Fluorophore oder Indo-1-Farbstoff
.
- Erstellen Sie eine Vertiefung für Einzelfärbekontrollen für alle zusätzlichen Zellpopulationen von Interesse (benutzerdefinierte Antikörper) unter Verwendung von Antikörper-konjugierten Fluorophoren in einem Durchflusszytometrie-Panel-Design. Dazu gehört nicht der ratiometrische Farbstoff Indo-1.
- Fügen Sie den Fc-Rezeptor-blockierenden Antikörper (~2 μg/1 x 106 Zellen) gemäß den Anweisungen des Herstellers hinzu, bevor Sie zusätzliche Fluorochrom-konjugierte Antikörper für die Oberflächenfärbung hinzufügen.
- Die Platte 45 min bei 37 °C mit 5 % CO 2 inkubieren.
- Resuspendieren Sie die Zellen in einer 12-Well-Platte, indem Sie alle 15 Minuten vorsichtig auf die Platte klopfen.
- Mischen und entfernen Sie das gesamte Volumen der im Medium suspendierten Zellen aus der 12-Well-Platte. Geben Sie dann die Zellsuspension in 1,7-ml-Mikrozentrifugenröhrchen.
- Pelletieren Sie die Zellen in einer Mikrozentrifuge bei 500 x g für 5 min bei Raumtemperatur. Dekantieren Sie den Überstand und waschen Sie die Zellen, indem Sie 1 ml vorgewärmtes cRPMI hinzufügen. Erneut pelletieren und den Überstand dekantieren.
Anmerkung: Durch das Waschen der Zellen werden alle verbleibenden Fc-blockierenden Antikörper entfernt.
- Resuspendieren Sie die Zellen in 1 mL cRPMI in 1,7 mL Mikrozentrifugenröhrchen und inkubieren Sie jedes Röhrchen bei 37 °C für weitere 30 Minuten mit 5 % CO2, wobei Sie die Oberseite des Röhrchens leicht geöffnet lassen, um einen Gasaustausch zu ermöglichen. Dies ermöglicht eine vollständige Entesterung der intrazellulären AM-Ester.
- Übertragen Sie die Zellen bei Bedarf zurück in eine 12-Well-Gewebekulturplatte. Zusätzliche benutzerdefinierte titrierte Fluorochrom-konjugierte Antikörper können in einer Ruhephase hinzugefügt werden.
Anmerkung: Zu den im Methodenpanel verwendeten Markern gehören: Ghost 540, CD4, CD8, TCRβ, TCRγδ, CD25 und CD1d/α-Galcer-Tetramer. Marker werden ausgewählt, um T-Zell-Teilmengen zu analysieren.
- Erstellen Sie einen Mastermix aller benutzerdefinierten Fluorochrom-konjugierten Antikörper entsprechend den interessierenden Zelltypen mit einem zuvor titrierten Volumen in ein 1,7-ml-Mikrozentrifugenröhrchen.
- Fügen Sie einen berechneten Mastermix für 1 ml des Zellvolumens hinzu, abhängig von titrierten Antikörpern gegen ruhende Zellen.
Anmerkung: Der Vorteil der Färbung in Schritt 2.15 gegenüber dem späteren Schritt 2.18 besteht darin, dass die Färbung in Schritt 2.15 die Gesamtinkubationszeit für das Experiment verkürzt. Die Färbung in einem Gesamtvolumen von 1 ml in Schritt 2.15 erhöht jedoch den Antikörperverbrauch.
- Nach der Ruhephase die Zellen bei 500 x g für 5 min bei Raumtemperatur pelletieren.
Anmerkung: Zellen in einer 12-Well-Gewebekulturplatte können in der Platte mit einer Plattenzentrifuge pelletiert werden. Andernfalls pelletieren Sie die Zellen in einem 1,7 mL Mikrozentrifugenröhrchen.
- Waschen Sie die Zellen, indem Sie das Pellet in 1 mL mit 4 °C kaltem cRPMI resuspendieren und die Zellen erneut wie in Schritt 2.16 pelletieren. Lege die Zellen auf Eis.
Anmerkung: Wenn die Zellen nach der Entesterung in Schritt 2.18 separat auf der Oberfläche gefärbt werden, wird weniger Antikörpervolumen benötigt. Die Oberflächenfärbung in diesem Schritt kann nach der Ruhephase in Kaltflusspuffer (1x Dulbecco's phosphatgepufferte Kochsalzlösung (DPBS) mit zugesetztem 1% FBS) unter Verwendung von benutzerdefinierten Antikörpern auf Eis für 30 min auf Eis durchgeführt werden. Waschen Sie die Zellen nach dem Fleck in cRPMI wie in Schritt 2.17.
- Den Viabilitätsfleck Ghost540 verdünnt 1:7.500 in DPBS gemäß den Anweisungen des Herstellers zu den Proben geben. Hitze tötet die Zellen bei 55 °C auf einem Erwärmungsblock ab, um eine einfache Lebend-/Totkontrolle zu ermöglichen.
Anmerkung: Die funktionelle Farbstofffärbung zur Beseitigung abgestorbener Zellen in der durchflusszytometrischen Analyse wird ohne FBS durchgeführt. FBS kann gemäß den Anweisungen des Herstellers mit Aminfarbstoffen interagieren.
- Resuspendieren Sie einzelne Proben in 500 μl cRPMI (phenolrotfrei) mit einem 5 mL Polystyrol-Durchflussröhrchen mit einer Kappe.
Anmerkung: Die Zellen können bis zu einer Stunde bei 4 °C belassen werden.
- Erwärmen Sie jedes 5-ml-Röhrchen mit den Zellen einzeln 7 Minuten lang mit einem Perlbad auf 37 °C, bevor Sie mit dem Durchflusszytometer analysiert werden, wobei die Zeit zwischen den Proben konstant bleibt. Verwenden Sie einen Timer.
>3. Perlenbadewanne: Aufrechterhaltung der Temperatur während der Kalziumflussanalyse
- Badeperlen in ein kleines Wasserbad ohne Zugabe von Wasser geben und auf 37 °C erwärmen.
- Schneiden Sie ein konisches 50-ml-Röhrchen vorsichtig bei der 25-ml-Markierung mit einer Rasierklinge in zwei Hälften und entsorgen Sie die Oberseite des Röhrchens.
- Füllen Sie die halbierte Tube zu 3/4 mit Badeperlen.
- Legen Sie das in Schritt 3.2 erstellte Rohr in das in Schritt 3.1 erstellte Perlenbad. Bringen Sie das Rohr und die Perlen auf 37 °C.
- Stecken Sie das Bead-Bad in eine Steckdose neben dem Durchflusszytometer, um die Temperatur zur Vorbereitung der Probenanalyse aufrechtzuerhalten.
- Fügen Sie ein konisches 50-ml-Styroporgestell hinzu, das so geschnitten ist, dass es ein Röhrchen hält, um das Röhrchen an Ort und Stelle zu positionieren, während es auf dem Durchflusszytometer läuft. Dadurch entfällt die Notwendigkeit, das Rohr für die Dauer der Kurvenanalyse manuell zu halten.
