Ein Assay zur Quantifizierung der Bindung von humanen Norovirus-VLPs an Darmbakterien

Zusammenfassung

Quelle: Madrigal, J. L., et al. Quantifizierung von humanen Norovirusvirus-ähnlichen Partikeln, die an kommensale Bakterien binden, mittels Durchflusszytometrie. J. Vis. Exp. (2020).

Dieses Video zeigt einen Assay zur Quantifizierung der Bindung von humanen Norovirusvirus-ähnlichen Partikeln (VLPs) an menschliche Darmbakterien. Die bakteriellen Suspensionen werden mit den VLPs vermischt und inkubiert, um die Bildung von VLP-Bakterienkomplexen zu ermöglichen. Die Komplexe werden dann mit Fluorophor-markierten VLP-spezifischen Antikörpern markiert, gefolgt von einer durchflusszytometrischen Visualisierung und Quantifizierung, um den Prozentsatz der VLP-gebundenen Bakterien zu identifizieren.

Protokoll

>1. VLP-Bakterien-Attachment-Assay

VORSICHT: Humane Norovirus-VLPs stellen eine Gefahr der Biosicherheitsstufe (BSL)-2 dar, und alle Arbeiten mit VLPs sollten in einer Biosicherheitswerkbank durchgeführt werden. Die Vorbereitung der Bakterienkulturen vor dem Attachment-Assay sollte unter für den Organismus geeigneten Sicherheitsbedingungen durchgeführt werden.

1. Vorbereitung der Reagenzien
   1. 1x phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)
      1. Bereiten Sie 1 l 10x PBS vor, indem Sie ein Päckchen in 1 l deionisiertem (DI) Wasser auflösen.
      2. Autoklavenlösung für 30 min.
      3. Bereiten Sie eine 1x-Lösung vor, indem Sie die obige Lösung 1:10 in DI-Wasser verdünnen.
      4. Filter: Sterilisieren Sie die Lösung, indem Sie sie durch einen 0,22-μm-Filter leiten und bei Raumtemperatur lagern.
   2. 5% BSA
      1. Geben Sie 5 g Rinderserumalbumin (BSA)-Pulver zu 100 ml PBS, um eine 5%ige (w/v) Lösung zu erhalten.
      2. Mischen Sie die Lösung durch Vortexen oder mit einem Metallrührstab auf einer Rührplatte, bis sich die Klumpen aufgelöst haben.
      3. Filter mit einem 0,22 μm Filter sterilisieren.
      4. Lagern Sie die Lösung bei 4 °C.
   3. Färbepuffer für Durchflusszytometrie (FCSB)
      1. Den gekauften FCSB (siehe Materialtabelle) durch einen 0,22 μm Filter filtern.
      2. Die restliche Lösung bei 4 °C lagern.
   4. 5 % Blockierungspuffer (BB)
      Anmerkung: Jedes Mal frisch zubereiten.
      1. Fügen Sie 0,5 g BSA zu 10 ml sterilem FCSB hinzu.
      2. Vortex, um die Probe gründlich zu mischen und bis zur Verwendung auf Eis zu lassen.
2. Antikörper-Konjugation
   1. Konjugieren Sie humane Norovirus-GII-Antikörper (siehe Materialtabelle) mit r-Phycoerythrin (PE) unter Verwendung eines R-PE-Antikörpermarkierungskits gemäß den Anweisungen des Herstellers (siehe Materialtabelle).
   2. Lagern Sie den konjugierten Antikörper im Dunkeln bei 4 °C für die zukünftige Verwendung in der VLP-Bakterium-Attachment-Assay-Analyse.
      Anmerkung: Der Primärantikörper sollte vor der Verwendung im VLP-Bakterien-Attachment-Assay titriert werden, um die richtige Konzentration zu bestimmen, die für die Durchflusszytometrie-Analyse erforderlich ist. Die Antikörpertitration sollte jedes Mal durchgeführt werden, wenn die Konjugationsreaktion durchgeführt wird, und für jedes Bakterium, das im Attachment-Assay verwendet wird.
3. Titration von Antikörpern
   1. Verdünnen Sie den konjugierten Anti-Human-Norovirus-GII-Antikörper 100-fach, mit einer Anfangsverdünnung von 1:100 und einer Endverdünnung von 1:600 (insgesamt sechs Verdünnungen).
   2. Führen Sie einen Virusanhaftungsassay wie unten beschrieben durch, mit folgender Ausnahme: In Schritt 1.5.7 resuspendieren Sie das Bakterienpellet in 350 μl 5 % BB.
   3. Die Probe wird in sieben 50-μl-Aliquoten aufgeteilt.
   4. Geben Sie 50 μl jeder Antikörperverdünnung in ein Röhrchen.
   5. Geben Sie 50 μl 5 % BB als ungefärbte Kontrolle in das siebte Röhrchen.
   6. Führen Sie die Durchflusszytometrie an allen Proben wie unten beschrieben durch.
   7. Vergleichen Sie verdünnte Antikörperproben mit ungefärbten Kontrollen und untereinander. Für nachfolgende Assays sollte die niedrigste Antikörperkonzentration gewählt werden, die nicht zu einer Abnahme oder einem Verlust des positiven Signals führt.
4. Aufbereitung von Bakterien
   1. Züchten Sie die Bakterien in 40 ml geeignetem flüssigem Medium unter geeigneten atmosphärischen Bedingungen, bis sich die Bakterien in der stationären Phase befinden.
      1. Enterobacter cloacae-Kulturen werden aerob über Nacht in Luria-Bouillon bei 37 °C gezüchtet und bei 200 U/min geschüttelt, um die stationäre Phase zu erreichen.
      2. Züchten Sie Lactobacillus gasseri-Kulturen in De Man-, Rogosa- und Sharpe-Bouillon (MRS) in schwarzen Schraubverschlussröhrchen ohne Schütteln in einem Wasserbad bei 37 °C für 18 Stunden, um die stationäre Phase zu erreichen.
   2. Übertragen Sie stationäre Phasenkulturen, um konische 50-ml-Röhrchen zu reinigen, und zentrifugieren Sie Proben bei 2.288 x g für 10 Minuten, um die Bakterien zu pelletieren.
   3. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie ihn in 13 mL sterilem 1x PBS. Wiederholen Sie diesen Waschschritt für insgesamt zwei Wäschen.
   4. Zentrifugieren Sie die Proben erneut, entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Proben in 20 mL 1x PBS.
      Anmerkung: Wenn das Zellpellet klein ist, kann das Resuspensionsvolumen verringert werden.
   5. Messen Sie den OD₆₀₀ der Kultur.
   6. Bestimmen Sie anhand einer Standardkurve die koloniebildende Einheit (KBE) pro ml der gewaschenen Kultur.
   7. Verdünnen Sie die Bakterien mit 1x PBS, um die Kulturkonzentration auf 1 x 10⁸ KBE/ml einzustellen.
   8. 1 ml der 1 x 10⁸ KBE/ml-Bakterienkultur in die erforderlichen 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen überführen.
   9. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 10.000 x g für 5 min.
   10. Resuspendieren Sie das Bakterienpellet in 1 ml sterilem 5%igem BSA.
   11. Inkubieren Sie die Röhrchen 1 h lang bei 37 °C mit konstanter Rotation.
5. Viren-Anhang
   1. In einer BSL-2-Biosicherheitswerkbank 10 μg humane Noroviren (HuNoV) VLPs (siehe Materialtabelle) in jedes Röhrchen geben, das in PBS resuspendierte Bakterien enthält, und durch Pipettieren gründlich mischen.
      Anmerkung: Die VLP-Konzentration ist bei jedem VLP-Präparat unterschiedlich. Daher variiert das Volumen, das den Bakterien zugesetzt wird, zwischen den Präparationschargen und sollte entsprechend angepasst werden, so dass 10 μg zu jedem Röhrchen im Experiment hinzugefügt werden. Für reine Bakterienkontrollen (z. B. Proben ohne VLP) fügen Sie ein Volumen PBS hinzu, das dem Volumen an VLP entspricht, das den experimentellen Proben zugesetzt wurde.
   2. Die Röhrchen 1 h bei 37 °C mit konstanter Rotation inkubieren.
      HINWEIS: Während der Inkubation wird ein Rohrrevolver (siehe Materialtabelle) verwendet, der auf 40 U/min eingestellt ist.
   3. Nach der Inkubation zentrifugieren Sie die Proben bei 10.000 x g für 5 min.
   4. Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Bakterienpellet in 1 ml PBS.
   5. Wiederholen Sie die Waschschritte 1.5.3 und 1.5.4.
   6. Zentrifugieren Sie die Proben bei 10.000 x g für 5 min.
   7. Überstand verwerfen und bakterielles Pellet in 150 μl 5 % BB resuspendieren.
6. Färbung von Antikörpern
   1. Frische 5% BB.
      zubereiten HINWEIS: Alle Arbeiten mit dem fluoreszenzmarkierten Antikörper sollten im Dunkeln durchgeführt werden, und der Antikörper, BB und FCSB sollten auf Eis gelegt werden.
   2. Verdünnen Sie humane Norovirus-GII-Antikörper 1:125 für E. cloacae-Proben und 1:150 für L. gasseri-Proben in 5 % BB und bereiten Sie 50 μl verdünnten Antikörper pro Probe vor.
   3. Der Isotyp-Antikörper wird auf die gleiche Weise verdünnt, wie der humane Norovirus-GII-Antikörper für jedes Bakterium in 5 % BB verdünnt wurde, wobei 50 μl verdünnte Isotypkontrolle pro Probe hergestellt werden.
   4. Jede Attachment-Assay-Probe aus Schritt 1.3.7 wird in drei 50-μl-Aliquote aufgeteilt, indem diese in saubere 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen überführt werden.
   5. Dem ersten Probensatz werden 50 μl BB zugesetzt. Bei diesem Set handelt es sich um die unbefleckten (Uns) Steuerelemente.
   6. Geben Sie 50 μl der GII-Antikörperverdünnung in den zweiten Satz. Daraus ergibt sich eine finale Antikörperkonzentration von 1:250 für E. cloacae und 1:300 für L. gasseri. Bei diesem Probensatz handelt es sich um die gefärbten (AB) Proben.
   7. 50 μl des verdünnten Isotyp-Antikörpers zum dritten Satz hinzufügen. Bei diesem Set handelt es sich um die Isotyp-Steuerungen (IC). Durch Pipettieren gut mischen. Inkubieren Sie die Proben auf Eis und im Dunkeln für 30 min.
   8. Zentrifugieren Sie alle Proben bei 10.000 x g für 5 min.
   9. Der Überstand wird verworfen und die Proben in 100 μl FCSB resuspendiert.
   10. Alle Proben werden 5 Minuten lang bei 10.000 x g zentrifugiert. Der Überstand wird verworfen und die Proben werden in 100 μl FCSB resuspendiert.
   11. Zentrifugieren Sie alle Proben bei 10.000 x g für 5 min.
   12. Der Überstand wird verworfen und die Proben in 150 μl FCSB resuspendiert.
   13. Jede Probe wird in ein FCSB-Röhrchen mit 400 μl FCSB-Puffer für ein Gesamtvolumen von 550 μl überführt.
   14. Bewahren Sie die Proben bis zur Analyse durch Durchflusszytometrie bei 4 °C auf.
       Anmerkung: Die Durchflusszytometrie wird innerhalb von 4 Stunden nach der Antikörperfärbung durchgeführt.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
5 ml Polystrene-Röhrchen mit rundem Boden und Zellsiebkappe	Corning	352235	Nach der Antikörperfärbung wird die Probe zur durchflusszytometrischen Analyse in Röhrchen überführt.
AnaeroPack	Thermo Scientific	R681001	Anaerobe Gaspackung zur Kultivierung von Lactobacillus gasseri
BD FacsDiva Software
BD LSR Fortessa Durchflusszytometer
Rinderserumalbumin	Fisher Bioreagenzien	Nr. BP1605	Wird für die Durchflusszytometrie verwendet
Fleckenpuffer für die Durchflusszytometrie (FCSB)	BD Biowissenschaften	554657	Wird für die Durchflusszytometrie verwendet
Maus IgG2b Kappa-Isotyp-Kontrolle (eBMG2b), PE, eBioscience	Thermo Fisher Scientific	12473281	Kontrolle des Isotyps. Dieser Antikörper wird in der konjugierten Form vom Hersteller gekauft.
MRS Pulver	BD Biowissenschaften	Artikel-Nr.: 288130	Wird zur Medienvorbereitung und zur Kultivierung von Lactobacillus gasseri verwendet.
Monoklonaler Antikörper Norovirus-Kapsid G2 (L34D)	Thermo Fisher Scientific	MA5-18241	Norovirus GII Antikörper. Dieser Antikörper ist nur in der unkonjugierten Form erhältlich und muss daher vor der Verwendung in den skizzierten Durchflusszytometrie-Assays fluoreszenzkonjugiert werden. In diesem Protokoll wurde PE als Fluor gewählt, jedoch können auch andere fluoreszierende Moleküle ausgewählt werden, die am besten zu dem vom Forscher verwendeten Durchflusszytometer passen.
Norovirus GII.4 VLP	Kreative Biostruktur	CBS-V700	VLPs wurden mit Hilfe des Baculovirus-Systems erzeugt und in phosphatgepufferter Kochsalzlösung mit 10 % Glycerin resuspendiert. Die Autoren führten unabhängige Nanosight-Tracking-Analysen durch, um die Partikelkonzentration der VLPs zu bestimmen. Die Konzentration beträgt ca. 1011 VLPs pro Milliliter. Basierend auf der Proteinkonzentration der VLPs werden in VLP-Attachment-Assays etwa 200 Partikel pro Bakterium zugegeben.
PBS 10X	Fisher Bioreagenzien	Nr. BP665	Vor Gebrauch auf 1X verdünnen.
SiteClick R-PE Antikörper-Markierungskit	Thermo Fisher Scientific	Nr. S10467	Konjugationskit zum Etikettieren von unkonjugierten Antikörpern.
Natriumchlorid	Fisher Scientific	Nr. S271	Wird für die Medienvorbereitung verwendet
Trypton	Oxoid	Nr. LP0042	Wird für die Medienvorbereitung verwendet
Rohr-Revolver	ThermoFisher Scientific	88881001	Wird im Virus:Bakterium-Attachment-Assay verwendet. Auf maximale Drehzahl (40 U/min) einstellen.
Hefeextrakt	BD Biowissenschaften	Artikel-Nr.: 212750	Wird für die Medienvorbereitung verwendet
Agar	Sigma	Nr. A7002	Wird für die Medienvorbereitung verwendet