>1. Nachweis von Mitophagie bei C. elegans
HINWEIS: Der Fadenwurm C. elegans bietet eine Plattform, um die Mitophagie auf organismischer Ebene zu testen. Zur Überwachung der Mitophagie können zwei Stämme verwendet werden: (1) Mitochondrien-zielgerichtete Rosella (mtRosella) oder (2) Mitophagie-Rezeptor DCT-1, fusioniert mit GFP zusammen mit dem autophagosomalen Marker LGG-1, fusioniert mit Discosoma sp. rot fluoreszierendes Protein (DsRed).
- Mitophagie-Monitoring mit Rosella Biosensor
HINWEIS: Rosella ist ein molekularer Biosensor, der ein pH-unempfindliches DsRed mit einer pH-empfindlichen GFP-Variante kombiniert. Der Rosella-Biosensor nutzt die pH-Unterschiede zwischen dem sauren Lysosom (pH ~4,5) und anderen zellulären Kompartimenten. Dieser Biosensor wurde zur erfolgreichen Überwachung der Mitophagie in Saccharomyces cerevisiae und mehreren Säugetierzelllinien wie HeLa, HEK293 und HCT116 eingesetzt. Wir adaptierten diesen vielseitigen dual-fluoreszierenden Reporter und erzeugten transgene C. elegans-Nematoden, die mitochondrien-gerichtete Rosella (mtRosella) in Körperwandmuskelzellen exprimieren. Die Mitophagie-Induktion wird durch ein reduziertes GFP/DsRed-Verhältnis der mtRosella-Fluoreszenz angezeigt.
- Tag 1: Entnehmen Sie L4-Larven von Würmern, die Mitochondrien-zielgerichtete Rosella (mtRosella) in Körperwandmuskelzellen exprimieren, mit einem Dissektionsmikroskop auf eine mit E. coli (OP50) besiedelte Nematoden-Wachstumsmedienplatte (NGM). 10-20 Würmer/Platte auf mindestens drei 3,5 cm Platten legen. Inkubieren Sie die Nematoden bei der Standardtemperatur von 20 °C.
Anmerkung: Siehe Referenz für die Anatomie des Wurms, einschließlich der Identifizierung von L4-Larven und der Art und Weise, wie man eine Hacke herstellt, die verwendet wird, um Würmer von einem Ort zum anderen zu übertragen.
- Tag 5: Synchronisieren Sie Nematoden, indem Sie 15-20 L4-transgene Larven auswählen und auf frische, mit OP50-Samen beseedete NGM-Platten übertragen. Verwenden Sie mindestens fünf Platten pro Versuchsbedingung.
- Tag 7: Bereiten Sie Fahrzeugschilder für Mitophagie-beeinflussende Medikamente von Interesse oder Positivkontrollen vor.
- Tötet E. coli (OP50)-Bakterien, die ausgesät wurden, indem NGM-Platten 15 Minuten lang mit 222 μW/cm2 (Intensität) UV-Licht belichtet werden, um sicherzustellen, dass Mitophagie-induzierende Verbindungen nicht von Bakterien metabolisiert werden. Die Platten müssen mit 2.000 J/m2,
belichtet werden
HINWEIS: Benötigte Belichtungssekunden = 2.000/((Intensität in μW/cm2)*100).
- Fügen Sie die interessierende(n) Verbindung(en) auf die Oberseite der ausgesäten NGM-Platten hinzu. Als Negativkontrolle eine entsprechende Menge Verbundfahrzeug (Lösungsmittel, das zum Auflösen von Verbindungen verwendet wird, wie z. B. Dimethylsulfoxid (DMSO)) auf die Fahrzeugschilder geben. Zur Positivkontrolle der Mitophagie-Induktion wurde ein mitochondriales Toxin, Paraquat (8 mM Endkonzentration), verwendet. Eine Lösung mit 10 μl 8 M Paraquat-Stamm und 190 μl ddH2O auf die Oberseite der Agarplatte für die Behandlungsgruppe geben. Für die Vehikelgruppe wird eine Lösung mit 10 μl DMSO und 190 μl ddH2O auf die Oberseite der Agarplatte gegeben.
Anmerkung: Die Paraquat-Arbeitslösung kann 1 Monat lang bei 4 °C aufbewahrt werden.
- Schwenken Sie die Platten vorsichtig, bis das Medikament oder Vehikel die gesamte Oberfläche bedeckt. Lassen Sie die Platten bei geschlossenen Deckeln mindestens 1 h bei Raumtemperatur trocknen, bevor Sie die Würmer übertragen.
Anmerkung: Medikamentenplatten können auch hergestellt werden, indem Medikamente in das flüssige NGM gegeben werden, bevor es sich verfestigt.
- Tag 7: 10-20 von 2 Tage alten adulten transgenen Tieren, die in Schritt 2.1.2 hergestellt wurden, auf Platten übertragen, die entweder Paraquat, die Verbindung(en) von Interesse oder das Vehikel (DMSO) enthalten. Die transgenen Tiere werden 2 Tage lang bei 20 °C inkubiert.
- Tag 9: Bereiten Sie 2% Agarose-Pads vor. Fügen Sie dann einen Tropfen (10 μL) 20 mM Levamisol in M9 pro Pad hinzu. Immobilisieren Sie die transgenen Tiere für die Bildgebung, indem Sie sie in den M9-Levamisol-Tropfen legen. Legen Sie vorsichtig ein Deckglas auf die Oberseite.
- Erfassen Sie einzelne transgene Tiere mit einer Kamera, die an einem Epifluoreszenzmikroskop befestigt ist. Erfassen Sie Fluoreszenzbilder von ganzen transgenen Nematoden, die mtRosella in Körperwandmuskelzellen exprimieren, bei 10-facher Vergrößerung. Speichern Sie die gesammelten Bilder.
- Verarbeiten Sie die aufgenommenen Bilder mit der ImageJ-Software. Analysieren Sie die Muskelzellen der Körperwand, die sich im Kopf des Wurms befinden, um Autofluoreszenz im Darmgewebe zu vermeiden. Messen Sie den durchschnittlichen Pixelintensitätswert und die Gesamtfläche für jedes Fluoreszenzbild nur des Kopfbereichs jedes Tieres. So analysieren Sie den spezifischen Interessenbereich:
- Wählen Sie "Geteilter Kanal" unter dem Dropdown-Menü "Bild" und "Farbe", um Bilder zu konvertieren.
- Verwenden Sie das Werkzeug "Freihandauswahl", um den fluoreszierenden Bereich von Interesse zu erfassen.
- Wählen Sie im Dropdown-Menü "Analysieren" den Befehl "Messung" und führen Sie die Pixelintensitätsanalyse durch.
- Die Pixelintensität sollte normalisiert werden, indem die Intensität durch den gesamten analysierten Bereich dividiert wird. Berechnen Sie nach der Normalisierung das Verhältnis von GFP zu DsRed.
- Verwenden Sie eine statistische Analysesoftware, um entweder den t-Test der Schüler (Vergleich zwischen zwei Gruppen) oder die ANOVA (Vergleich zwischen mehreren Gruppen) für die statistische Analyse mit p < 0,05 als signifikant durchzuführen.
- Beurteilung der Mitophagie anhand der Ko-Lokalisation zwischen DCT-1 und LGG-1
HINWEIS: DCT-1 ist ein äußeres mitochondriales Membranprotein, das als Mitophagierezeptor als Reaktion auf Stressbedingungen fungiert, ähnlich wie seine mutmaßlichen Orthologe BNIP3 und NIX/BNIP3L bei Säugetieren. Daher wird die Mitophagie-Initiation durch Ko-Lokalisation zwischen dem DCT-1-Mitophagie-Rezeptor und dem autophagosomalen Membranprotein LGG-1 (Homolog des Säugetier-LC3) bewertet.
- Tag 1: L4-Larven von transgenen Tieren, die sowohl DCT-1::GFP als auch DsRed::LGG-1 in Körperwandmuskelzellen5 exprimieren, werden auf eine OP50-ausgesäte NGM-Platte gepflückt. 5-10 Würmer/3,5 cm Platte platzieren und mindestens drei Platten verwenden. Inkubieren Sie die Nematoden bei 20 °C.
Anmerkung: Die Transgene befinden sich auf separaten Plasmiden und sind nicht in das Genom integriert. Nehmen Sie Nematoden auf, die sowohl rol-6(su1006)- als auch pmyo-2-GFP-Kontransformationsmarker tragen. Nur transgene Würmer mit beiden Kontransformationsmarkern exprimieren sowohl DCT-1::GFP als auch DsRed::LGG-1 in Körperwandmuskelzellen.
- Führen Sie die Schritte von 1.1.2-1.1.5 aus.
- Bilden Sie einzelne Muskelzellen an der Körperwand mit einer Kamera ab, die an einem konfokalen Mikroskop befestigt ist. Erkennen Sie die Grenzen ganzer Muskelzellen an der Körperwand und nehmen Sie Z-Stack-Bilder mit 63-facher Vergrößerung auf. Auch eine höhere Vergrößerung kann verwendet werden.
- Öffnen und verarbeiten Sie Bilder, die mit der konfokalen Software aufgenommen wurden. Der Beginn der Mitophagie wird durch die Kolokalisation des Mitophagierezeptors (DCT-1::GFP) an den autophagosomalen Marker (DsRed::LGG-1) angezeigt. Messen Sie manuell Co-Lokalisationsereignisse in jedem Stapel von Körperwand-Muskelzellen. Es ist wichtig, dass alle Mikroskop- und Kameraeinstellungen (Objektiv und Lupe, Filter, Belichtungszeit, Auflösung, Laserintensität, Verstärkung usw.) während der gesamten Experimente konsistent bleiben. Alle Einstellungen sollten beachtet werden.
- Verwenden Sie eine statistische Analysesoftware, um entweder den t-Test der Schüler (Vergleich zwischen zwei Gruppen) oder die ANOVA (Vergleich zwischen mehreren Gruppen) für die statistische Analyse mit p < 0,05 als signifikant durchzuführen. Für bidirektionale Vergleiche verwenden Sie den Student's t-Test (p < 0,05 wird als signifikant angesehen). Für Mehrfachvergleiche verwenden Sie die Einzelfaktor-Varianzanalyse (ANOVA), die durch den Post-hoc-Bonferroni-Test korrigiert wird. Wir empfehlen, für jede Versuchsbedingung mindestens 50-70 Tiere oder 30-50 Körperwandmuskelzellen zu analysieren. Wiederholen Sie das Experiment mindestens dreimal.
