Alle Verfahren, die die Probenentnahme beinhalten, wurden in Übereinstimmung mit den IRB-Richtlinien des Instituts durchgeführt.
>1. Vorbereitung von Puffern und Reagenzien
HINWEIS: Bereiten Sie alle Proben gemäß den Richtlinien des Herstellers vor. Tragen Sie während dieses Vorgangs persönliche Schutzausrüstung (Laborkittel, Handschuhe und Schutzbrille).
- Citrat-Waschpuffer wird hergestellt, indem 0,941 g Saccharose (11 mM Endkonzentration), 6,4 ml 5 M Natriumchlorid (NaCl, 128 mM endgültig), 5,4 ml 0,2 M Mononatriumphosphat (NaH2PO4, 4,3 mM endgültig), 9,4 ml 0,2 M Dinatriumphosphat (Na2HPO4, 7,5 mM endgültig), 0,352 g Natriumcitrat (4,8 mM endgültig) kombiniert werden. und 0,115 g Zitronensäure (2,4 mM endgültig). Stellen Sie das Gesamtvolumen mit ddH2O auf 250 mL ein. Filtern Sie durch eine 0,45 μm Filterscheibe und stellen Sie den pH-Wert auf 6,5 ein. Bis zu 1 Jahr bei 4 °C lagern. Bringen Sie die Lösung vor Gebrauch auf Raumtemperatur (RT).
- Bereiten Sie den Berstpuffer vor, indem Sie 250 mM Saccharose, 1 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) und 10 mM Tris (Hydroxymethyl)-aminomethanhydrochlorid (Tris-Cl, pH 7,4) in einem Endvolumen von 100 mL kombinieren. Bis zu 1 Jahr bei 4 °C lagern. 2 μl Phosphatase-Hemmer-Cocktail (1:1000 endg.) und 1 μl Protease-Hemmer-Cocktail (1:2000 endg.) in 2 ml Rbruchpuffer geben. Bis zur Verwendung auf Eis aufbewahren. Verwerfen Sie den nicht verwendeten Berstpuffer.
>2. Isolierung von Blutplättchen
- Sammeln Sie 8–10 ml menschliches Blut in einem Blutentnahmeröhrchen mit gelber Kappe, das Säure-Citrat-Dextrose (ACD)-Lösung enthält (75 mM Trinatriumcitrat, 124 mM Dextrose und 38 mM Zitronensäure, pH = 7,4; ACD: Blut = 1:9). Den Tubeninhalt 5x–6x vorsichtig mit der Hand umdrehend mischen.
- Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 200 x g in einem schwingenden Schaufelrotor für 20 min bei RT.
- Sammeln Sie plättchenreiches Plasma (PRP) (~3–4 ml) in einem konischen 15-ml-Bodenröhrchen und lassen Sie etwa 0,5 mL des PRP aus dem Buffy-Coat (trüb aussehende Fraktion), um eine Kontamination zu vermeiden. Wenn eine Kontamination der roten Blutkörperchen auftritt, wiederholen Sie diesen Schritt.
- Zentrifugieren Sie die PRP-Proben bei 1.200 x g für 15 min bei RT.
- Waschen Sie das Plättchengranulat (P1) durch schonende Resuspension in 1 mL Citratwaschpuffer und das Pellet durch Zentrifugation bei 1.200 x g für 15 min bei RT.
- Bewahren Sie das reine Plättchenpellet auf. Entsorgen Sie den Überstand.
- Resuspendieren Sie die Thrombozytenpellets in 600 μl des Rupturpuffers, der Inhibitorcocktails enthält.
- Beschallen Sie die Thrombozytensuspension mit einem Ultraschallgerät. Geben Sie die Probe in einen Mini-Eiskübel. Stellen Sie den Ultraschallator auf Stufe 3 für 20 s im Dauerbetrieb.
HINWEIS: Reinigen Sie die Sonde mit 10 % Bleichmittel, gefolgt von destilliertem Wasser.
- Zentrifugieren Sie die beschallten Proben bei 20.000 x g für 30 min bei 4 °C, um membranöse Fraktionen zu entfernen. Überstände in 60 μl aliquotieren und bei -80 °C lagern. Wiederholtes Auftauen/Einfrieren der zytosolischen Thrombozytenfraktionen ist zu vermeiden.
>3. Vorbereitung für den Kapillarelektrophorese-Immunoassay (CEI)
HINWEIS: 100 μl humanes Thrombozytenlysat wurden von ALS-Patienten (n = 8–10) kombiniert, und gesunde Probanden (n = 8–10) wurden separat gepoolt und für die Assay-Optimierung verwendet.
- Füllen Sie intern erstellte Vorlagen für das CEI-Layout (Tabelle 1) und die Probenvorbereitung (Tabelle 2) aus. Die Tabelle zur Vorbereitung der Probenmischung ist dynamisch und berechnet automatisch, wie viel Volumen von der Quelle entfernt werden muss.
HINWEIS: Wenn das erforderliche Quellvolumen in die dynamische Tabelle 2 eingegeben wird, wird automatisch 0,1 X Sample-Puffervolumen berechnet.
- Beschriften Sie 25 0,2 mL PCR-Röhrchen mit den Kapillaren #1–#25 und legen Sie sie in ein PCR-Rack. Auf Eis legen.
- 0,6-ml-Mikrozentrifugenröhrchen vor der Etikettierung: eines für jeden zu verwendenden Primärantikörper und jede zu verwendende Verdünnung (falls erforderlich), eines für den 0,1-fachen Probenpuffer, eines für das Luminol-S/Peroxid und eines für jede zu verdünnende Probe (falls erforderlich). Lege sie auf Eis in ein Röhrengestell.
- Nehmen Sie den Probenpuffer, den Waschpuffer, eine Platte und eine Kartusche heraus, die im CEI-Trennmodul für das 12–230 kDa Master-Kit-Trennmodul enthalten sind.
- Nehmen Sie den Antikörperverdünnungspuffer, die Primärantikörper, die Sekundärantikörper, das Luminol, das Wasserstoffperoxid und die Standardpackung aus dem 4 °C-Kühlschrank. Legen Sie alle Reagenzien auf Eis, mit Ausnahme der Standardpackung, die bei RT.
verbleibt.
HINWEIS: Die Reagenzien aus den Standardpackungen sind lyophilisiert und mit einer Folienabdeckung versiegelt. Um Produktverluste zu reduzieren, sollten diese vor dem Öffnen mit einer Mini-Zentrifuge kurz heruntergeschleudert werden. Zum Öffnen können die Reagenzröhrchen mit einer Pipettenspitze durchstochen oder aus der Ecke zurückgezogen werden.
- Zur Herstellung des 400 mM Dithiothreitols (DTT) geben Sie 40 μl deionisiertes Wasser in das durchsichtige Röhrchen, das das DTT enthält.
- Zur Herstellung von 40 μl fluoreszierendem 5x-Mastermix geben Sie 20 μl des 10x Probenpuffers und 20 μl der vorbereiteten 400 mM DTT-Lösung in das rosa Röhrchen, das im Kit enthalten ist.
- Zur Vorbereitung der biotinylierten Leiter geben Sie 16 μl deionisiertes Wasser, 2 μl 10x Probenpuffer und 2 μl der vorbereiteten 400 mM DTT-Lösung in das im Kit enthaltene weiße Röhrchen. Vorsichtig mischen und zur Denaturierung in ein 0,2-ml-Polymerase-Kettenreaktionsröhrchen (PCR) geben.
- Bereiten Sie 0,1x Probenpuffer vor, indem Sie 1,5 μl 10x Probenpuffer und 148,5 μl deionisiertes Wasser in ein 0,6 mL Mikrozentrifugenröhrchen geben. Vortex zum Mischen und auf Eis legen.
- Bereiten Sie die gewünschten Antikörperverdünnungen vor. Fügen Sie das Antikörperverdünnungsmittel in den Volumina hinzu, die für jedes vormarkierte Mikrozentrifugenröhrchen bestimmt sind. Wenn die Volumina identisch sind, verwenden Sie die umgekehrte Pipettiertechnik. Ist dies nicht der Fall, spülen Sie die Pipettenspitze vor dem Dispensieren vor.
HINWEIS: In diesem Assay wurden der Pan-Antikörper A-TDP-43 und der Antikörper a-p(S409/410-2) TDP-43 verwendet. Anti-ERK-Antikörper wurden für die interne Kontrolle verwendet, um sicherzustellen, dass die Assay-Komponenten funktionierten.
- Führen Sie das umgekehrte Pipettieren zur Antikörperverdünnung wie unten beschrieben durch. Alternativ finden Sie weitere Informationen in der Literatur.
HINWEIS: Rückwärtspipettieren wird bevorzugt, wenn kleine aufeinanderfolgende Mengen von Lösungen dosiert werden. Diese Technik bietet einige Vorteile: (i) Bereitstellung eines präzisen Volumens, (ii) Eliminierung der Schaumbildung des Reagenzes in der Spitzenöffnung und (iii) ideal für Reagenzien mit kleinem Volumen (<5 μl), viskose Lösungen, Tensidlösungen und Lösungen mit hohem Dampfdruck.
- Stecken Sie eine geeignete Spitze in eine Pipette und drücken Sie den Kolben bis zum zweiten Anschlag nach unten (Schritt 2). Tauchen Sie die Pipettenspitze einige Millimeter in die Lösung. Lassen Sie den Kolben langsam los, um die Pipettenspitze mit der Lösung zu füllen, während die Spitze noch eingetaucht ist. Nehmen Sie die Spitze aus der Lösung und berühren Sie sie vorsichtig mit dem Rand des Reagenzbehälters, so dass überschüssige Flüssigkeit, die an der Außenseite der Spitze verbleibt, entfernt wird.
- Geben Sie die Lösung ab, indem Sie den Kolben bis zum ersten Anschlag drücken (Schritt 1). Geben Sie die restliche Lösung nicht in die Spitze ab.
- Entleeren Sie die restliche Lösung in der Spitze in das Reagenzreservoir, indem Sie den Kolben bis zum zweiten Anschlag drücken (Schritt 2). Lassen Sie den Kolben in die Bereitschaftsposition für den nächsten Pipettierschritt.
- Fügen Sie den erforderlichen Antikörper in Volumina hinzu, die jedem vormarkierten Mikrozentrifugenröhrchen zugeordnet sind (Tabelle 1). Spülen Sie die Pipettenspitze nicht vor: Geben Sie sie direkt in das Verdünnungsmittel und spülen Sie die Spitze mehrmals, um den Antikörper zu entfernen. Lege die Röhren auf Eis.
- Um die CEI-Probenmischung vorzubereiten, führen Sie die unten aufgeführten Schritte für PCR-Röhrchen mit der Bezeichnung cap#2 bis cap#25 durch: Dies ist in der gleichen Reihenfolge wie in Tabelle 1.
- Öffnen Sie alle Röhrchen, geben Sie 1,6 μl Aliquots fluoreszierenden 5x-Probenpuffers mit einer umgekehrten Pipettiertechnik in jedes Röhrchen und verschließen Sie dann jedes PCR-Röhrchen nach Zugabe des 5x-Puffers, um den Probenverlust zu minimieren.
- Öffnen Sie alle Röhrchen, fügen Sie jedem Röhrchen 0,1x Probenpuffer in den in Tabelle 2 angegebenen Volumina hinzu und schließen Sie es unmittelbar danach. Wenn die Volumina identisch sind, verwenden Sie eine umgekehrte Pipettiertechnik. Ist dies nicht der Fall, spülen Sie die Pipettenspitze vor, bevor Sie 0,1x Probenpuffer ausgeben.
- Öffnen Sie alle Röhrchen, geben Sie die Proteinprobe in den in Tabelle 2 angegebenen Volumina in jedes Röhrchen und verschließen Sie sie unmittelbar danach. Wenn die Volumina identisch sind, verwenden Sie die umgekehrte Pipettiertechnik. Ist dies nicht der Fall, spülen Sie die Pipettenspitze vor, bevor Sie 0,1x Probenpuffer ausgeben.
- Zentrifugieren Sie alle PCR-Röhrchen kurz in einer Tischzentrifuge (13.000 x g für 30 s), schnippen/wirbeln Sie die PCR-Röhrchen zum Mischen und wiederholen Sie dann die Zentrifugation.
- Übertragen Sie alle PCR-Röhrchen in einen Thermocycler mit beheiztem Deckel. Denaturieren Sie Proben bei definierter Temperatur und Dauer (d. h. 95 °C für 5 min; 70 °C für 10 min).
HINWEIS: Die Denaturierungstemperatur und -dauer müssen für das Zielprotein optimiert werden.
- Wiederholen Sie Schritt 3.12.4.
- Legen Sie alle PCR-Röhrchen wieder in das Röhrchengestell und legen Sie sie auf Eis.
- Während des Denaturierungsschritts wird die Entwicklungslösung (1:1 Luminol-S: Peroxidlösung) hergestellt, dann 200 μl Luminol-S und 200 μl Peroxid hinzugefügt. Auf Eis legen.
- Um eine vorgefüllte CEI-Platte mit der oben vorbereiteten Probe zu bestücken, geben Sie Reagenzien und Proben in die im Assay-Layout gezeigte Assay-Platte (Abbildung 1). Vermeiden Sie das Einbringen von Luftblasen.
HINWEIS: Wenn Volumen und Lösung identisch sind, verwenden Sie eine umgekehrte Pipettiertechnik. Ist dies nicht der Fall, spülen Sie die Pipettenspitze vor der Abgabe vor und werfen Sie den Rest nicht mit dem zweiten Tabstopp an der Pipette in die Plattenvertiefung aus. Ein Separationsmodul mit 12 bis 230 kDa kann eine farbcodierte Plattenladeanleitung enthalten. Platzieren Sie diese Führung unter der Platte, während Sie Reagenzien und Proben in die Vertiefung geben, was beim Laden der Proben visuell hilft. Die Anleitung zum Plattenladen kann auch auf der Website des Unternehmens heruntergeladen werden.
- 15 μl Luminol: Peroxid-Mischung in jede Vertiefung in Reihe E geben.
HINWEIS: Bereiten Sie dieses Reagenz idealerweise kurz vor der Verwendung vor und geben Sie es in jede Vertiefung. Wenn dies ungünstig ist, darf diese Mischung nicht länger als 30 Minuten vor dem Laden der Platte hergestellt werden.
- In Reihe D bis Vertiefung D1 werden 10 μl Streptavidin-HRP zugegeben.
- In Reihe D werden in die Vertiefungen D2–D25 10 μl des benannten Sekundärantikörpers gegeben
.
- Geben Sie in Reihe B 10 μl Antikörperverdünnungsmittel in jede Vertiefung
.
- In Reihe C bis Vertiefung C1 werden 10 μl Antikörperverdünnungsmittel zugegeben.
- In Reihe C werden in die Vertiefungen C2–C25 10 μl des angegebenen Primärantikörpers gegeben
.
- Fügen Sie in Reihe A zu Vertiefung A1 5 μl biotinylierte Leiter aus dem PCR-Röhrchen #1 hinzu.
- Geben Sie in Reihe A zu den Vertiefungen A2–A25 3 μl der Probe und die PCR-Röhrchen #2–#25 in die entsprechenden Vertiefungen #2–#25.
- Geben Sie 500 μl Waschpuffer in jede dafür vorgesehene Waschpuffervertiefung.
- Zentrifugieren Sie die Platte 5 min lang bei 1.000 x g bei RT.
Tabelle 1: Vorlage für das Laden von CEI-Assay-Platten.
Tabelle 2: Interaktive Vorlage für die Vorbereitung von Probenmischungen. Nach Eingabe der Stammproteinkonzentration aus unbekannten Proben berechnen interaktive Zellen automatisch, wie viel Volumen für die Vorbereitung der Probenmischung verwendet werden muss.
