Ein magnetischer Nanopartikel-basierter Immunoassay mit einem mikrofluidischen Gerät

>1. Vorbereitung des Geräts

1. Füllen Sie die Kanäle mit einer Spritze mit destilliertem Wasser. Stellen Sie sicher, dass es keine Undichtigkeiten oder Strömungswiderstände gibt. Tauchen Sie das Gerät 10 Minuten lang in ein Ultraschallbad, um verbleibende Acryl-, Klebstoff- oder unerwünschte Materialien in den Kanälen zu entfernen.
2. Entleeren Sie das Wasser in den Gerätekanälen. Verwenden Sie eine Spritze, um eine Blockierungslösung einzuführen, die mit 5 % (w/v) Rinderserumalbumin (BSA) hergestellt wurde, das in 1x Tris-gepufferter Kochsalzlösung (TBS) verdünnt und zuvor durch einen 0,2 μm Polyethersulfon (PES)-Spritzenfilter filtriert wurde.
3. Bereiten Sie eine Suspension aus Eisenmikropartikeln mit einem Durchmesser von 7,5 μm in 5 % BSA.
   Anmerkung: Die Mikropartikel werden zuvor mit einer Siliziumdioxid-Polyethylenglykol (PEG)-Schicht funktionalisiert, die eine Beständigkeit gegen die Proteinabsorption verleiht.
4. Inkubieren Sie den Chip und die Mikropartikelsuspension mit der Blockierlösung für mindestens 1 h bei Raumtemperatur. Wenn möglich, über Nacht bei 4 °C blockieren lassen.

>2. Bildung von Mikropartikelfallen

1. Führen Sie die Mikropartikel mit einer Spritzennadel durch den Seitenkanalauslassschlauch in den Chip ein. Platzieren Sie den Chip senkrecht und lassen Sie die Mikropartikel unter Einwirkung der Schwerkraft durch den Seitenkanal fließen. Drehen Sie den Chip um 180° in zwei Stufen von 90° und lassen Sie die Mikropartikel bei der 5-μm-Beschränkung anvisieren und verdichten.
2. Entfernen Sie überschüssige Mikropartikel durch eine um 45° drehende Schwerkraft in Richtung des Seitenkanals.
3. Halten Sie das Gerät aufrecht, um ein Lösen der Mikropartikelfalle zu vermeiden. In Abbildung 1B finden Sie eine Zusammenfassung des Prozesses der Bildung von Mikropartikelfallen.

>3. Immunoassay

1. Vorbereitung von Nanopartikeln
   1. Nehmen Sie 2 μl der Suspension von 100-nm-Nanopartikeln, die zuvor mit Lysozym konjugiert wurden (Antigenmodell). Geben Sie es in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit 100 μl Blockierungslösung. Über Nacht bei 4 °C inkubieren.
   2. Fügen Sie 150 μl Waschpuffer (1x TBS, 0,05 % Tween 20) hinzu.
   3. Legen Sie das 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen in einen Magnetabscheider. 15 Minuten aufbewahren, damit sich die Nanopartikel trennen können (Abbildung 2).
      Anmerkung: Das Mindestvolumen für den Magnetabscheider beträgt 200 μl. Vermeiden Sie die Verwendung eines kleineren Volumens.
   4. Entfernen Sie die Flüssigkeit mit einer Mikropipette aus dem Röhrchen. Vermeiden Sie den Kontakt mit der Wand des Röhrchens, in der das Nanopartikel-Pellet gebildet wurde.
   5. Fügen Sie 250 μl frischen Waschpuffer hinzu. Halten Sie das Rohr 15 Minuten lang unter Rühren.
   6. Wiederholen Sie die Schritte 3.1.3.-3.1.5. 2x weiter, nur 5 min schütteln.
   7. Fügen Sie die gewünschte Konzentration des primären Anti-Lysozym-Antikörpers hinzu (siehe Materialtabelle). Stellen Sie auf ein Endvolumen von 100 μl im Antikörperverdünnungsmittel ein (1x TBS, 1 % BSA, 0,05 % Tween 20).
   8. 15 Minuten bei 37 °C inkubieren. Weitere 15 Minuten bei Raumtemperatur schütteln.
   9. Wiederholen Sie die Waschschritte 3.1.2.-3.1.6.
   10. Fügen Sie 100 μl Antikörperverdünnungsmittel hinzu. Den Meerrettichperoxidase-gekoppelten Sekundärantikörper (HRP-AbII) (siehe Materialtabelle) in einer Verdünnung von 1:500 zugeben.
   11. Wiederholen Sie die Waschschritte 3.1.2.-3.1.6.
   12. Bewahren Sie die Nanopartikel in einem Endvolumen von 50 μl Antikörperverdünnungsmittel auf.

>4. Experimentelle Montage

1. Füllen Sie die beiden 100-μl-Glasspritzen mit Wasser, schließen Sie an jede Spritze einen 6,5 cm langen Schlauch an, stecken Sie einen Metallstift in das Schlauchende und legen Sie beide Spritzen auf die computergesteuerte Spritzenpumpe.
2. Versiegeln Sie alle Schläuche des Acrylgeräts mit Hitze.
3. Schneiden Sie den Zulaufschlauch ab und halten Sie ihn nur wenige Millimeter fest. Füllen Sie die Dosiernadel mit Waschpuffer und führen Sie ihn in den geschnittenen Schlauch ein. Lassen Sie die Lösung tropfen, bevor Sie die Nadel mit dem Gerät verbinden, um den Luftzugang zum Gerät zu verhindern.
4. Schneiden Sie den Auslaufschlauch aus dem seitlichen Kanal ab. An die Spritzenpumpe anschließen. Führen Sie als Nächstes das gleiche Verfahren für den Hauptkanalauslassschlauch aus.
   Anmerkung: Es ist wichtig, die Schritte 4.3.-4.4 durchzuführen. in dieser Reihenfolge, um ein Auspacken der Mikropartikelfalle zu vermeiden. Wenn möglich, überprüfen Sie den Zustand der Falle während dieser Schritte mit Hilfe einer Lupe.
5. Legen Sie einen Objektträger auf den Mikroskoptisch. Befestigen Sie den Magneten mit doppelseitigem Klebeband an der Rutsche und legen Sie auf jede Seite ein kleines Stück Klebeband, um die Chipkanten am Glas zu befestigen.
6. Stellen Sie eine Durchflussrate von 50 μl/h über die Registerkarten Durchflussrate und Einheiten in der Spritzenpumpensteuerung ein. Wählen Sie den Rückzugsmodus und klicken Sie auf die Schaltfläche Start, um den Fluss des Waschpuffers zu aktivieren.
7. Nähern Sie sich dem Gerät vorsichtig in horizontaler Weise in Richtung des Schiebers mit dem Magneten, so dass der Bereich des Chips, der die Falle enthält, den Magneten berührt.
8. Kleben Sie die Kanten des Geräts mit doppelseitigem Klebeband auf das Glas, um Bewegungen zu verhindern. Vermeiden Sie es, den Strahlengang für die Mikroskopie zu blockieren (Abbildung 1C).

>5. Immunnachweis

1. Lassen Sie den Waschpuffer 10 Minuten lang bei 50 μl/h fließen, um überschüssiges BSA zu entfernen.
2. Entfernen Sie den restlichen Waschpuffer mit einer Mikropipette von der Dosiernadel. Fügen Sie 50 μl der Nanopartikelsuspension hinzu.
3. Lassen Sie die Suspension der Nanopartikel 7 Minuten lang bei einer Durchflussrate von 100 μL/h fließen. Ändern Sie anschließend die Durchflussrate auf 50 μL/h und fließen Sie weitere 15 Minuten lang.
4. Wechseln Sie die Dosiernadel. Lassen Sie den Waschpuffer 10 Minuten lang bei 50 μL/h laufen. Bereiten Sie das fluorogene Substrat während des Waschschritts nach Herstellerangaben vor.
5. Entfernen Sie den restlichen Waschpuffer mit einer Mikropipette von der Dosiernadel. 100 μl des fluorogenen Substrats zugeben (siehe Materialtabelle). Fließen Sie das fluorogene Substrat 6 min lang bei 50 μL/h.
6. Stellen Sie die Messparameter für die Durchflussrate (1 μl/h, 3 μl/h, 5 μl/h und 10 μl/h) und die Zeit (6 min) in den entsprechenden Registerkarten "Durchflussrate" und "Timer einstellen" der Schnittstelle ein, die die Spritzenpumpe steuert. Stellen Sie sicher, dass Sie für jede der durchzuführenden Messungen den Rückzugsmodus auswählen.
7. Stellen Sie eine zusätzliche Durchflusslasche auf 50 μL/h ein und stellen Sie den Timer für den Waschschritt auf 3 Minuten ein.
8. Schalten Sie die Fluoreszenz des Mikroskops 15 s vor dem Stoppen des Substrats bei 50 μL/h ein. Starten Sie die Bilderfassung mit der Software der Mikroskopkamera 10 s vor dem Stopp des Substrats mit einer Belichtungszeit von 1.000 Millisekunden. Führen Sie die Bildgebung 6 Minuten lang mit 1 Bild/s (FPS) durch.
9. Klicken Sie auf die Schaltfläche Start des gewünschten Durchflussparameters, unmittelbar nachdem die Durchflussrate der Substratwäsche bei 50 μL/h gestoppt wurde. Klicken Sie auf die Schaltfläche Start des Waschflusses (50 μL/h), unmittelbar nachdem der ausgewählte Messfluss gestoppt wurde.
10. Stoppen Sie die Bildaufnahme und schalten Sie die Fluoreszenz des Mikroskops aus, um ein Photobleichen des Substrats zu vermeiden.
11. Wiederholen Sie die Schritte 5.8.-5.10. für jede verwendete Messdurchflussmenge.

Abbildung 1: Endgültige Gerätekonfiguration. (A) Acrylgerät, bei dem die Schläuche an den entsprechenden Ein- und Ausgängen befestigt sind. Die Skala zeigt die Abmessungen des Geräts in Zentimetern an. (B) Protokoll für die Bildung der Mikropartikelfalle. Mikropartikel fließen durch die Schwerkraft durch den Kanal, wenn das Gerät in einer vertikalen Position platziert wird. Mikropartikel werden bei der 5-μm-Beschränkung konzentriert. Überschüssige Mikropartikel lassen sich leicht entfernen, indem der Chip durch den Seitenkanal gedreht wird. Der Chip wird vertikal gehalten, um die Falle vor dem Immunoassay zu konservieren. (C) Mikrofluidische Vorrichtung, die auf einem Glasobjektträger, der den Magneten enthält, auf dem Tisch des inversen Fluoreszenzmikroskops montiert ist. Die Dosiernadel, durch die die Reagenzien zugegeben werden, sowie die Auslassschläuche, die mit einer Spritzenpumpe verbunden sind, werden beobachtet.

Abbildung 2: Abscheidung von Nanopartikeln. Mit einem handelsüblichen Magnetseparator können 100-nm-Nanopartikel leicht konzentriert werden, um die Waschschritte während des Immunoassays durchzuführen. Das nach 15 Minuten gebildete Pellet ist im roten Kreis zu sehen.