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HINWEIS: Die Eierstockkrebszelllinie OVCAR3 wurde in diesen Schritten verwendet, aber dieses Protokoll ist weitgehend auf mehrere andere Zelllinien anwendbar, einschließlich solcher, die aus nicht-ovariellen Quellen stammen. Ein Schema des Protokolls ist in Abbildung 1 dargestellt.
>1. Plattieren der Zellen
- Stellen Sie Poly-L-Lysin-beschichtete Deckgläser her.
- Geben Sie autoklavierte Deckgläser mit einem Durchmesser von 12 mm in ein konisches 50-ml-Röhrchen mit Poly-L-Lysin-Lösung und legen Sie es für 15 Minuten auf eine Wippe.
- Aspirieren Sie die Lösung in einer Gewebekulturhaube. Waschen Sie die Deckgläser mit sterilem Wasser und legen Sie die Tube mit den Deckgläsern für 5 Minuten wieder auf die Wippe. Wiederholen Sie diesen Waschschritt dreimal.
- Verteilen Sie die beschichteten Deckgläser auf einer sterilen Schale und saugen Sie das restliche Wasser ab. Lassen Sie die Deckgläser 1 h in der Gewebekulturhaube trocknen oder bis keine Wassertröpfchen mehr übrig sind. Nach dem Trocknen die Form mit Parafilm verschließen und bei 4 °C erhitzen.
- Legen Sie ein mit Poly-L-Lysin beschichtetes Deckglas in jede Vertiefung einer 24-Well-Platte. Die Verwendung von Poly-Lysin-Deckgläsern ist entscheidend, um zu verhindern, dass sich die Zellen während des Vorextraktionsschritts von den Deckgläsern lösen.
- Trypsinisieren Sie OVCAR3-Zellen, sobald sie eine Konfluenz von 70 % bis 80 % erreichen.
- Um eine 10 cm große Kulturschale zu trypsinisieren, die zu 70 % bis 80 % konfluent ist, saugen Sie das Medium aus der Platte ab und waschen Sie es mit 5-7 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS).
- Aspirieren Sie das PBS, fügen Sie 1 ml 0,25 % Trypsin hinzu und stellen Sie die Schale für 8-10 Minuten in einen 37 °C-Inkubator oder bis sich die Zellen vom Boden der Platte abheben.
- Sammeln Sie die Zellen mit 5-10 mL Medium und geben Sie sie in ein konisches Röhrchen.
- Zählen Sie die Zellen manuell mit einem Hämozytometer unter Verwendung von Standardverfahren.
- Nehmen Sie eine Verdünnung von 25.000 Zellen/ml vor und fügen Sie 1 ml der Zellen auf Poly-L-Lysin-Deckgläser hinzu, die in die Vertiefungen der 24-Well-Platten gelegt werden. Bestimmen Sie für jede andere Zelllinie eine Anzahl, bei der die Zellen nach drei Populationsverdopplungen zu etwa 70 % bis 80 % konfluent sind.
- Züchten Sie die Zellen im Kulturmedium unter Standardbedingungen.
>2. Pulsierende Zellen mit IdU
- Damit sich die Zellen richtig auf den Deckgläsern ausbreiten können, reicht eine Verdopplung der Population. Nach einer Populationsverdopplung pulsieren die Zellen mit 10 μM 5-Iod-2'-Desoxyuridin (IdU) (siehe Materialtabelle zur Rekonstitution von IdU) für die beiden folgenden Populationsverdopplungen.
Anmerkung: Wir haben verschiedene Thymidin-Analoga ausprobiert, darunter Bromodeoxyuridin (BrdU), 5-Chlor-2′-Desoxyuridin (CIdU) und IdU. Unter den drei Analoga bietet IdU das beste Signal-Rausch-Verhältnis. Vergleichsbilder von Zellen, die mit den drei verschiedenen Analoga gepulst wurden, sind in Abbildung 2 dargestellt. Wir empfehlen die Verwendung von zwei Negativkontrollen: (i) eine gepulste Probe ohne IdU und (ii) eine Kontrolle ohne primären Antikörper. Wenn die Bildung von ssDNA aufgrund einer bestimmten Behandlung beurteilt werden muss, empfehlen wir, das Medikament nach der ersten Runde der IdU-Verdopplung hinzuzufügen.
- Nachdem Sie zwei Populationsverdopplungen lang mit IdU gepulst haben, ernten Sie die Zellen für die Bildgebung.
- Ersetzen Sie das Medium durch eiskaltes 0,5 % PBSTx (PBS + 0,5 % Triton X-100) auf Eis für 5 min. Dieser Vorextraktionsschritt hilft bei der Freisetzung zytoplasmatischer und nicht-chromatingebundener Proteine, wobei die Chromatin-gebundenen Proteine intakt bleiben. Bestimmte Zelllinien können sich während der Vorextraktion leicht ablösen. In einem solchen Szenario kann man 0,5 % CSK-Puffer (10 mM PIPES (pH 6,8), 100 mM Natriumchlorid (NaCl), 300 mM Saccharose, 3 mM Magnesiumchlorid (MgCl2), 1 mM Ethylenglykoltetraessigsäure (EGTA) und 0,5 % Triton X-100 verwenden.
>3. Fixierung
- PBSTx aspirieren und 15 min mit 3 % Paraformaldehyd (PFA) (Table of Materials) bei Raumtemperatur inkubieren, gefolgt von drei bis vier Wäschen mit 1x PBS. Die fixierten Zellen können bis zu weiteren Schritten bei 4 °C gehalten werden.
ACHTUNG: PFA ist hochgiftig und krebserregend. Vermeiden Sie den Kontakt mit Haut, Augen und Schleimhäuten. Führen Sie alle Schritte mit PFA in einem Abzug durch und entsorgen Sie die Materialien ordnungsgemäß.
>4. Permeabilisierung und Blockierung
- Nach der Fixierung permeabilisieren Sie die Zellen mit 0,5 % PBSTx auf Eis für 5 Minuten. Verwenden Sie genügend Volumen, um das gesamte Deckglas zu bedecken (typischerweise zwischen 500 μl und 1 ml).
- Waschen Sie die Zellen drei- bis viermal mit 0,2 % PBST (1X PBS + 0,2 % Tween-20) bei Raumtemperatur. Ein ml PBST reicht aus, um jede Mulde zu waschen. Führen Sie die Wäschen Rücken an Rücken ohne Inkubationen durch.
- Aspirieren Sie das PBST und blockieren Sie die Proben mit 5 % Rinderserumalbumin, BSA (Table of Materials), hergestellt in 1x PBS (Blockierungspuffer) für 30 Minuten bei Raumtemperatur.
>5. Immunfärbung mit dem IdU-Antikörper
- Für die Immunfärbung bereiten Sie eine befeuchtete Kammer vor (feuchtes Papiertuch auf einer Tupperdose mit flachem Boden). Decken Sie den Deckel der 24-Well-Platte mit Parafilm ab, legen Sie ihn in die befeuchtete Kammer und legen Sie die Deckgläser auf den Plattendeckel.
- Bereiten Sie den primären Anti-BrdU-Maus-Antikörper (Materialtabelle) vor, indem Sie ihn 1:200 in dem Blockierungspuffer aus Schritt 4.2 verdünnen. Es wurde bereits gezeigt, dass der Anti-BrdU-Antikörper IdU nachweist.
- Geben Sie 60 μl IdU-Antikörperverdünnung auf die Deckgläser. Die Deckgläser 1 h bei 37 °C inkubieren.
- Alternativ können Sie weniger Antikörperlösung verwenden, wenn die Deckgläser auf einen Tropfen (20-25 μl) mit 1:200 Antikörperverdünnung gekippt werden, der auf Parafilm pipettiert wird. Dies verringert auch die Wahrscheinlichkeit, dass die Lösung während der Inkubation austrocknet.
- Nach der 1-stündigen Inkubation aspirieren Sie den primären Antikörper. Legen Sie die Deckgläser wieder auf eine 24-Well-Platte und waschen Sie sie viermal mit 0,2 % PBST.
- Für den Sekundärantikörper ist die gleiche befeuchtete Kammer zu verwenden, die in Schritt 5.1 beschrieben wurde. Verdünnen Sie den konjugierten Anti-Maus-Sekundärantikörper (Materialtabelle) im Blockierungspuffer (1:200). Geben Sie 60 μl Sekundärantikörper auf die Deckgläser und inkubieren Sie ihn 1 Stunde lang bei Raumtemperatur im Dunkeln. Dieser Sekundärantikörper ist lichtempfindlich.
- Aspirieren Sie den Sekundärantikörper. Legen Sie die Deckgläser wieder auf die 24-Well-Platte und waschen Sie sie viermal mit 0,2 % PBST.
- Beschriften Sie Objektträger mit Mikroskopobjektträgern und montieren Sie die Deckgläser mit 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) Eindeckmedium auf die Objektträger (Materialtabelle). Lagern Sie Dias im Dunkeln bei Raumtemperatur für 24 h. Die 24-stündige Inkubation wird empfohlen, wenn das Einbettmedium ausgehärtet oder ausgehärtet werden muss.
Anmerkung: Die Objektträger können dann bei 4 °C gelagert werden, bevor sie auf einem Fluoreszenzmikroskop abgebildet werden. Ein repräsentatives Bild ist in Abbildung 3 dargestellt.
