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Alle Verfahren, die die Probenentnahme beinhalten, wurden in Übereinstimmung mit den IRB-Richtlinien des Instituts durchgeführt.
>1. Herstellung und Lagerung von Snap-Chips
- Einfach-Transfer-Methode (Abbildung 1a)
- Spot-cAb-Lösungen, die 400 μg/ml Antikörper und 20 % Glycerin in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) enthalten, auf einen Nitrozellulose-Assay-Objektträger (oder ein funktionalisiertes Glas) mit einem Inkjet-Microarray-Spotter bei einer relativen Luftfeuchtigkeit von 60 % (1,2 nL für jeden Spot) mit einem Mittenabstand von 800 μm. Stellen Sie sicher, dass die Rutsche entsprechend einer Ecke auf dem Spotter-Deck befestigt ist (hier wurde die untere linke Ecke verwendet).
- Inkubieren Sie den gefleckten Objektträger 1 h lang bei Raumtemperatur und einer relativen Luftfeuchtigkeit von 60 %.
- Klemmen Sie eine Dichtung des Objektträgermoduls mit 16 Kammern auf den Assay-Objektträger, um ihn in 16 Vertiefungen zu unterteilen. Spülen Sie den Objektträger dreimal, indem Sie 80 μl PBS mit 0,1 % Tween-20 (PBST) in jede Vertiefung geben und bei 450 U/min auf einem Shaker jeweils 5 Minuten schütteln.
- Geben Sie 80 μl Blockierungslösungen in jede Vertiefung und schütteln Sie sie 1 Stunde lang bei 450 U/min.
- Entfernen Sie die Dichtung und trocknen Sie den Assay-Objektträger mit einem Stickstoffstrahl.
- Befestigen Sie eine Transferrutsche auf dem Spotter-Deck und drücken Sie die untere linke Ecke der Rutsche gegen die untere linke Ecke des Spotter-Decks. Inkjet erkennt ein Array von Ausrichtungsmarkierungen (eine Lösung aus Polystyrol-Mikrokügelchen) mit dem gleichen Layout wie für die Capture-Antikörper (cAbs).
- Lassen Sie die Ausrichtungsmarkierungen trocknen. Drehen Sie den Transferschieber um und setzen Sie ihn wieder auf das Spotter-Deck und befestigen Sie ihn an der unteren linken Ecke.
- Bereiten Sie die Nachweisantikörper-Lösungen (dAb) vor, die 20 μg/ml Antikörper, 20 % Glycerin und 1 % Rinderserumalbumin (BSA) enthalten.
- Machen Sie mit der Kamera des Spotters ein Bild von einer Ausrichtungsmarke. Implementieren Sie dieses Bild als Fiducial in das Spotting-Programm und lassen Sie das Bilderkennungssystem des Inkjet-Spotters die obere linke Markierung identifizieren. Verwenden Sie die Koordinate als ersten Punkt des dAb-Arrays. Spot 8 nL pro Tröpfchen mit einem Mittenabstand von 800 μm.
- Methode der doppelten Übertragung (Abbildung 1b)
- Platzieren Sie einen Transferobjektträger 1 auf dem Inkjet-Spotter-Deck in der unteren linken Ecke. Spot-cAbs-Lösungen mit 400 μg/ml Antikörpern, 20 % Glycerin und 1 % BSA in PBS mit einem Inkjet-Microarray-Spotter bei einer relativen Luftfeuchtigkeit von 60 % (0,4 nL für jeden Spot und ~ 200 μm Durchmesser) auf den Objektträger aufbringen. Der Achsabstand beträgt 400 μm.
- Lassen Sie den Transferobjektträger mit einem Nitrozellulose-beschichteten (oder funktionalisierten Glas) Assay-Objektträger mit einem Schnappgerät (Abbildung 2) einrasten, um die cAb-Tröpfchen auf den Assay-Objektträger zu übertragen.
- Drehen Sie alle sechs Tasten an der Seite des Druckknopfes um 90 Grad, um alle Kolben in der geöffneten Position zu ziehen und zu verriegeln. Setzen Sie den Transferschieber in den Objektträgerhalter in seiner Aufnahme ein, wobei die abgeschnittene Ecke zum festen Pogo-Stift zeigt. Drehen Sie den ersten Satz von drei Knöpfen, um die Stößel mit dem goldenen Pogo-Stift zu lösen, und stellen Sie sicher, dass die Schieber gegen die Ausrichtungsstifte gedrückt werden.
- Setzen Sie einen mit Nitrozellulose beschichteten Schieber kopfüber auf die 4 Pogo-Pins in das Schnappgerät ein. Drehen Sie den zweiten Satz von drei Tasten, um die Stößel mit dem silbernen Stift zu lösen, und stellen Sie sicher, dass die Schieber gegen die Ausrichtungsstifte gedrückt werden.
- Schließen Sie die Schnappvorrichtung, indem Sie die obere Schale mit den Ausrichtungssäulen und -löchern auf den Schlittenhalter legen, um eine präzise Positionierung zu gewährleisten.
- Setzen Sie das geschlossene Schnappgerät in seinen Käfig ein und drücken Sie die Verschlusslasche vollständig nach unten, um die Microarrays unter dem entsprechenden Druck gegenüberzubringen. 1 Min. geschlossen halten.
- Trennen Sie die Folien. Inkubieren Sie den Objektträger 1 h lang bei Raumtemperatur und einer relativen Luftfeuchtigkeit von 60 %. Waschen, blockieren und trocknen Sie den Assay-Objektträger wie in den Schritten 1.1.3 bis 1.1.5 beschrieben.
- Legen Sie einen weiteren Transferobjektträger auf das Inkjet-Spotter-Deck und drücken Sie ihn gegen die untere linke Ecke. Spot-dAb-Lösungen mit 50 oder 100 μg/ml Antikörpern (siehe Tabelle 1), 20 % Glycerin und 1 % BSA in PBS. Stellen Sie sicher, dass jeder Spot 0,8 nL beträgt und der Mittenabstand zwischen den Spots 400 μm beträgt.
- Bewahren Sie den Assay und den Objektträger auf. Verschließen Sie sowohl den Assay- als auch den Transferobjektträger in einem luftdichten Beutel mit Trockenmittel und stellen Sie ihn in einen Gefrierschrank bei -20 °C.
>2. Multiplex-Immunoassays mit Snap-Chips
- Nehmen Sie den Assay-Objektträger aus dem Gefrierschrank. Lassen Sie den Beutel 30 Minuten lang verschlossen, bis der Objektträger Raumtemperatur erreicht hat.
- Bereiten Sie seriell verdünnte 7-Punkt-Probenlösungen her, indem Sie Proteine in PBS mit einem Gehalt von 0,05 % Tween-20 spiken.
Anmerkung: Hier kommt ein 5-facher Verdünnungsfaktor zum Einsatz. Die Ausgangskonzentrationen für jedes Protein sind in Tabelle 1 aufgeführt.
- Bereiten Sie gegebenenfalls Probenlösungen vor. Verdünnen Sie zum Beispiel Humanserum 4-mal in PBST-Puffer
.
- Klemmen Sie eine 16-Kammer-Dichtung auf den Assay-Objektträger.
- Füllen Sie eine Säule mit 8 Wells mit den 7 Proteinverdünnungslösungen und einer proteinfreien PBST-Pufferlösung durch Pipettieren. Pipettieren Sie die Probenlösungen in den anderen 8 Vertiefungen auf demselben Objektträger.
HINWEIS: In jede Vertiefung passen 80 μl Lösungen. Bei Bedarf können mehr Objektträger verwendet werden, um zusätzliche Proben zu messen.
- Die Proben werden auf einem Schüttler bei 450 U/min entweder 1 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 °C inkubiert. Waschen Sie den Objektträger dreimal mit PBST auf dem Schüttler bei 450 U/min, jeweils 5 Minuten. Entfernen Sie die Dichtung und trocknen Sie den Schieber unter einem Strom von Stickstoffgas.
- Nehmen Sie den Transferobjektträger mit dAbs aus dem Gefrierschrank. Bewahren Sie den Beutel 30 Minuten lang verschlossen bei Raumtemperatur auf. Inkubieren Sie den Objektträger dann 20 Minuten lang in einer geschlossenen Kammer (z. B. leere Spitzenbox) mit 60 % Feuchtigkeitsstabilisierungsperlen zur Rehydrierung.
- Schnappen Sie den Transferobjektträger mit dem Assay-Objektträger mit einer Schnappvorrichtung ein (Abbildung 2), um die dAb-Tröpfchen zu übertragen. Siehe Abschnitt 1.2.2 für die Funktionsweise der Schnappvorrichtung.
- Trennen Sie die Folien. Inkubieren Sie den Assay-Objektträger 1 h lang in einer geschlossenen Kammer mit 60 % Feuchtigkeitsstabilisierungsbeads. Klemmen Sie den Assay-Objektträger mit einer 16-Kammer-Dichtung fest und spülen Sie den Objektträger 4 Mal mit PBST auf einem Schüttler bei 450 U/min, jeweils 5 Minuten.
- Pipettieren Sie 80 μl Lösungen mit 2,5 μg/ml Streptavidinfluorophor in PBS in jede Vertiefung. 20 min auf einem Shaker bei 450 U/min inkubieren.
- Spülen Sie den Objektträger 3 Mal mit PBST und einmal mit destilliertem Wasser auf dem Shaker bei 450 U/min. Entfernen Sie die Dichtung und trocknen Sie den Schieber mit Stickstoffgas.
>3. Scannen von Objektträgern und Datenanalyse
- Scannen Sie den Assay-Objektträger mit einem Fluoreszenz-Microarray-Scanner mit dem 635-nm-Laser.
- Extrahieren Sie die Nettointensität jedes Spots mit einer Analysesoftware (z. B. array-pro analyzer).
- Berechnen Sie die Nachweisgrenze (LOD) jedes Proteins mit einer Statistiksoftware und bestimmen Sie die Proteinkonzentrationen in den Proben.
Anmerkung: Der LOD ist definiert als der Y-Ausschnitt der Standardkurve, der um das Dreifache der Standardabweichung von drei unabhängigen Assays erhöht wird.
Tabelle 1. Proteinkonzentrationen und LODs im Puffer aus dem 50-Plex-Assay. Die Detailgenauigkeit für CA 15-3 wird in U/ml (*) angegeben.
kg
kg
kg
kg
| Name des Proteins | Ausgangskonzentration (ng/ml) | LOD (pg/ml) | Name des Proteins | Ausgangskonzentration (ng/ml) | LOD (pg/ml) |
| ANG2 | 500 | 1.3 × 104 | IL-6b | 1 | 2.1 × 102 |
| BDNF | 500 | 1,0 × 102 | IL-5 | Nr. 50 | 77 |
| CA 15-3* | 1 | 4.9 × 103 | IL-4 | 1000 | 1.5 × 104 |
| Cea | 1000 | 5.4 × 103 | IL-2 | Nr. 50 | Nr. 76 |
| CXCL10/IP-10 | Nr. 50 | 1.7 × 102 | Lep | 200 | 4,0 × 102 |
| Crp | 200 | Nr. 44 | Mig | 500 | 11 × 102 |
| DEU | 1000 | 6.2 × 102 | CCL3/MIP-1α | Nr. 50 | 3.3 |
| EGF | Nr. 50 | 1.8 × 102 | CCL4/MIP-1β | Nr. 50 | 12 |
| EGFR | 200 | 1.9 × 102 | MMP-3 | 500 | 1,0 × 102 |
| FAS-L | 500 | 4.5 × 102 | M-CSF | 500 | 8.2 × 103 |
| FGF | 500 | 1,0 × 103 | MMP-9 | 200 | 3.1 × 102 |
| G-CSF | 500 | 39 | CCL2/MCP-1 | Nr. 50 | 55 |
| GM-CSF | Nr. 50 | 3,8 | NCAM-1 | 500 | 1.7 × 103 |
| GRO-α | Nr. 50 | 3,0 × 102 | β-NGF | 200 | 1.4 × 103 |
| HER2 | 500 | 3.5 × 103 | NT-3 | 200 | 5.8 × 102 |
| PDGF-BB | 200 | 73 | OPN (Englisch) | 500 | 1.9 × 103 |
| IL-1β | 500 | 7.9 × 102 | RBP4 | 200 | 1.2 ×102 |
| IL-1ra | 200 | 1.1 × 103 | Sparc | 1000 | 4.6 ×104 |
| IL-15 | Nr. 50 | 8.2 × 102 | TNF-α | Nr. 50 | 4,4 |
| IL-12 | 1 | 30 | TNF-RI | Nr. 50 | 1.3 × 102 |
| IL-11 | 500 | 1.2 × 103 | TNF-RII | Nr. 50 | 12 |
| IL-10 | 500 | 6.1 ×102 | FAS/TNFRSF6 | 200 | 2.8 ×102 |
| IL-8 | Nr. 50 | 6,6 | uPA | 200 | 24 |
| IL-7 | 2,5 | 26 | uPAR(CD87) | 200 | Nr. 76 |
| IL-6A | 1000 | 84 | VEGF | 200 | 6.7 × 102 |
