Alle Verfahren, die die Probenentnahme beinhalten, wurden in Übereinstimmung mit den IRB-Richtlinien des Instituts durchgeführt.
>1. Färbung mit dem ersten Antikörper
- Entwachsung und Rehydrierung von formalinfixierten, paraffineingebetteten (FFPE) Objektträgern mit 5 Minuten für jeden der folgenden Schritte: Xylol oder gleichwertige Reagenzien 3x, 100 % Ethanol 2x, 95 % Ethanol 1x, 70 % Ethanol 1x, 50 % Ethanol 1x und destilliertes Wasser 2x.
Anmerkung: Die Objektträger sollten ab diesem Rehydrationsschritt bis zur Montage im letzten Schritt feucht bleiben.
- Für eine optionale Antigen-Entnahme legen Sie die Objektträger 8 Minuten lang in 275 ml siedende Natriumcitratlösung (10 mM, pH = 6,0). Um die Lösung am Kochen zu halten, legen Sie die Objektträger flach auf den Boden einer 14 x 9,5 x9 cm großen Pipettenspitzenbox mit Deckel und stellen Sie die Lösung bei 70 % Leistung in einer 700-W-Mikrowelle für 8 Minuten in die Mikrowelle. Nehmen Sie dann die Pipettenspitzenbox aus der Mikrowelle, öffnen Sie den Deckel und lassen Sie die Lösung mindestens 20 Minuten lang bei Raumtemperatur (RT) abkühlen.
- Füllen Sie die Objektträger in ein Coplin-Glas mit PBST (phosphatgepufferte Kochsalzlösung mit 0,1 % Polysorbat 20/80). 3x 5 min mit PBST waschen. Wenn Sie nicht sofort zum nächsten Schritt übergehen, lagern Sie die Objektträger in diesem Schritt mit PBST in einem Coplin-Glas bei RT für einige Stunden oder bei 4 °C für 1-2 Tage, wenn Sie nicht sofort zum nächsten Schritt übergehen.
- Zur Herstellung der Blockierungslösung wird das normale Serum der Wirtsspezies des Sekundärantikörpers als Blockierungsreagenz verwendet. Es können auch andere handelsübliche Blockierungsreagenzien verwendet werden. Wenn normales Serum verwendet wird, das für die in dieser Studie vorgestellte Studie verwendet wurde, fügen Sie 100 μl normales Eselsserum zu 4,9 ml PBST hinzu. Die Blockierungslösung kann bis zu 3 Tage bei 4 °C gelagert werden.
- Zum Blockieren schütteln Sie das PBST von den Objektträgern ab und bedecken Sie diese schnell mit ausreichend Blockierlösung. Inkubieren Sie die Objektträger bei RT in einer befeuchteten Kammer für 30 Minuten.
- Bereiten Sie die Primärantikörperlösung (500 μl für zwei Objektträger) mit der Blockierungslösung vor, um den Primärantikörper auf die gewünschte Konzentration zu verdünnen. Die Lösung sollte bis zur Verwendung auf Eis gelagert werden.
- Für 3β-Hydroxysteroid-Dehydrogenase (3βHSD) fügen Sie 2 μl 3βHSD-Antikörper in 498 μl Blockierungslösung hinzu.
- Für Tyrosinhydroxylase (TH) fügen Sie 0,5 μl TH-Antikörper in 499 μl Blockierungslösung hinzu.
- Für β-Catenin fügen Sie 1 μl β-Catenin-Antikörper in 499 μl Blockierungslösung hinzu.
- Für 20α-Hydroxysteroid-Dehydrogenase (20αHSD) fügen Sie 1 μl 20αHSD-Antikörper in 499 μl Blockierungslösung hinzu.
- Für Cytochrom P450 2F2 (CYP2F2) fügen Sie 2 μl CYP2F2-Antikörper in 498 μl Blockierungslösung hinzu.
- Inkubieren Sie mit dem Primärantikörper, indem Sie die Blockierungslösung von den Objektträgern abschütteln und diese schnell mit ausreichend Primärantikörperlösung bedecken. Inkubieren Sie die Objektträger über Nacht in einer befeuchteten Kammer bei 4 °C. Während der Inkubation können die Objektträger mit einem kleinen Stück Paraffinfolie bedeckt werden, um ein Austrocknen zu verhindern.
- Am nächsten Morgen waschen Sie die Objektträger 3x 5 min lang mit PBST.
- Bereiten Sie die Sekundärantikörperlösung (500 μl für zwei Objektträger) unter Verwendung der Blockierungslösung vor, um den biotinylierten Sekundärantikörper auf die gewünschte Konzentration zu verdünnen (z. B. 1 μl Esel-Anti-Maus-Antikörper oder Esel-Anti-Kaninchen-Antikörper in 499 μL Blockierungslösung). Die Lösung sollte bis zur Verwendung auf Eis gelagert werden.
- Inkubieren Sie mit dem zweiten Antikörper, indem Sie PBST von den Objektträgern abschütteln und sie schnell mit ausreichend Sekundärantikörperlösung abdecken. Inkubieren Sie die Objektträger in einer befeuchteten Kammer für 1 h bei RT.
Anmerkung: Wenn endogenes Biotin ein Problem darstellt, verwenden Sie einen Peroxidase-konjugierten Sekundärantikörper anstelle des biotinylierten Sekundärantikörpers. Fahren Sie mit Schritt 1.14 fort, wenn Sie einen Peroxidase-konjugierten Sekundärantikörper in Schritt 1.10 verwenden.
- Waschen Sie die Objektträger 3x 5 min lang mit PBST.
- Bereiten Sie die Meerrettichperoxidase-konjugierte Streptavidin-Lösung (SA-HRP) (500 μl für zwei Objektträger) vor, indem Sie 0,5 μl SA-HRP in 499 μl PBS geben. Die Endkonzentration beträgt 1 μg/ml.
- Inkubieren Sie mit der SA-HRP-Lösung. Schütteln Sie PBST von den Objektträgern ab und bedecken Sie die Objektträger schnell mit ausreichend SA-HRP-Lösung. Inkubieren Sie die Objektträger in einer befeuchteten Kammer für 0,5 h bei RT.
- Waschen Sie die Objektträger 3x 5 min lang mit PBST.
- Bereiten Sie die Fluorophor-Tyramid-Lösung vor, indem Sie Fluorophor-Tyramid mit seinem Verdünnungspuffer gemäß den Anweisungen des Herstellers verdünnen (z. B. 5 μl Fluorophor-Tyramid in 496 μl Verdünnungspuffer).
- Führen Sie die Signalentwicklung mit Fluorophor-Tyramid durch, indem Sie PBST von den Objektträgern abschütteln und die Objektträger schnell mit ausreichend Fluorophor-Tyramid-Lösung abdecken. In einer befeuchteten Kammer 1 Minute bei RT inkubieren. Die Inkubationszeit kann angepasst werden, um die gewünschte Fluoreszenzintensität zu erreichen. Stoppen Sie die Reaktion, indem Sie die Objektträger in ein Coplin-Glas mit PBST geben. Waschen Sie die Objektträger 2x 3 min lang mit PBST.
- Die Signale können schnell unter einem Fluoreszenzmikroskop überprüft werden, um das Ergebnis in diesem Stadium zu bestätigen. Wenn keine Deckgläser verwendet werden, tragen Sie einen Tropfen Glycerin:PBS (1:1) auf jeden Abschnitt auf, um die Proben feucht zu halten. Waschen Sie die Objektträger 2x 3 min lang mit PBST. Objektträger können einige Tage bei PBST bei 4 °C gelagert werden, bevor sie zum nächsten Schritt übergehen.
>2. Entfernen des ersten Antikörpers
- Legen Sie die Objektträger für mindestens 8 Minuten in 275 ml siedende Natriumcitratlösung (10 mM, pH = 6,0). Halten Sie die Lösung am Kochen, indem Sie die Objektträger flach auf den Boden einer 14 x 9,5 x 9 cm3 (B x L x H) Pipettenspitzenbox mit Deckel legen und die Lösung bei 70 % Leistung in einer 700-W-Mikrowelle 8 Minuten lang in der Mikrowelle erhitzen. Wenn eine längere Abstreifzeit bevorzugt wird, kann es erforderlich sein, den Puffer mit einer siedenden Natriumcitratlösung aufzufüllen, um die Objektträger immer in Pufferlösung eingetaucht zu halten. Nehmen Sie die Pipettenspitze aus der Mikrowelle, öffnen Sie den Deckel und lassen Sie die Lösung mindestens 20 Minuten lang bei RT abkühlen.
- Übertragen Sie die Objektträger in ein Coplin-Glas mit PBST. 3x 5 min mit PBST waschen. Wenn der nächste Schritt nicht sofort ausgeführt wird, lagern Sie die Objektträger in einem Coplin-Glas mit PBST bei RT für einige Stunden oder bei 4 °C für 1-2 Tage.
>3. Färben mit dem zweiten Antikörper
- Beginnen Sie mit dem Blockierungsschritt und befolgen Sie die gleichen Verfahren wie in Schritt 1.5 bis Schritt 1.14. Bei den Signalentwicklungsschritten (Schritt 1.15 und Schritt 1.16) wird das Fluorophor-Tyramid in einem anderen Fluoreszenzspektrum verwendet.
Anmerkung: Objektträger können mit dieser Methode mehrmals abgestreift werden, um eine Multiplex-Färbung zu ermöglichen. Der letzte Antikörper benötigt kein Fluorophor-Tyramid als Reporter. Ein Fluorophor-konjugierter Sekundärantikörper könnte verwendet werden, um Signale des letzten Primärantikörpers anzuzeigen.
- Inkubieren Sie die Objektträger mit 2 μg/ml 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) oder Hoechst-Lösung für 1 min bei RT, wenn eine nukleare Gegenfärbung erforderlich ist. Waschen Sie dann die Objektträger 2x 3 min lang mit PBST.
