Multiplex-Immunfluoreszenz-Bildgebung zur Analyse immuntherapieresistenter T-Zell-Subpopulationen

Zusammenfassung

Quelle: Granier, C., et al. Multiplexed Immunfluoreszenzanalyse und Quantifizierung von intratumoralen PD-1⁺ Tim-3⁺ CD8⁺ T-Zellen. J. Vis. Exp. (2018).

Dieses Video demonstriert eine in-situ Fluoreszenz-Multispektral-Bildgebungstechnik zur Analyse verschiedener Subpopulationen von infiltrierenden T-Zellen im Tumorgewebe. Eine Kryosektion des Nierenzellkarzinoms wird mit Antikörpern behandelt, um CD8+ T-Zellen zu markieren, die spezifische inhibitorische Rezeptoren exprimieren und einen immuntherapieresistenten Phänotyp aufweisen. Der markierte Schnitt wird mit einem Multispektralmikroskop visualisiert, um die unterschiedlichen CD8+ T-Zell-Subpopulationen zu identifizieren.

Protokoll

Alle Verfahren, bei denen Proben entnommen werden, wurden in Übereinstimmung mit den IRB-Richtlinien des Instituts durchgeführt

>1. In situ Immunfluoreszenzfärbung von tumorinfiltrierenden Lymphozyten (TILs)

1. Verfahrensleitlinien
   1. Führen Sie alle Versuchsschritte bei Raumtemperatur durch.
   2. Führen Sie für alle Schritte die Verdünnungen mit Tris-Puffer-Kochsalzlösung (TBS; siehe Materialtabelle) durch.
   3. Führen Sie die Wäsche in TBS für alle Schritte außer nach der Inkubation des primären Antikörpers durch. Für Letzteres verwenden Sie Tris Buffer Saline Tween20 (TBST, siehe Materialtabelle). Zur Zusammensetzung und Rekonstitution des Puffers siehe Tabelle 1.
   4. Verwenden Sie eine Feuchtigkeitskammer für Antikörper-Inkubationen und ein Färbeglas zum Waschen.
   5. Lassen Sie den Abschnitt während des Eingriffs nicht austrocknen.
2. Vorbehandlung
   1. Tauen Sie den Objektträger mit der Gewebeprobe auf und trocknen Sie den Objektträger vorsichtig mit einem Papiertuch um die Probe herum. Den Reaktionsbereich, der das Gewebe enthält, mit einem hydrophoben Barrierestift abgrenzen (siehe Materialtabelle). 2 Min. trocknen lassen.
   2. Fixieren Sie die Proben 5 Minuten lang in 100 % Aceton, trocknen Sie sie 2 Minuten lang und waschen Sie sie 10 Minuten lang mit TBS.
3. Sättigung und Blockade
   1. Behandeln Sie die Objektträger 10 Minuten lang mit 3 Tropfen Avidin 0,1 %, klopfen und/oder schnippen Sie auf den Objektträger, um das Avidin zu verteilen und Luftblasen zu entfernen, und behandeln Sie dann 10 Minuten lang mit 3 Tropfen Biotin 0,01 % (siehe Materialtabelle), klopfen und/oder schnippen. Mit TBS waschen.
   2. Führen Sie eine Blockade der Fc-Rezeptoren durch. 100 μl eines Volumenanteils von 5 % normalem Serum, verdünnt in TBS, auftragen. Serum von derselben Wirtsspezies verwenden wie der markierte Sekundär- oder Tertiärantikörper (siehe Materialtabelle); Hier kam Eselserum zum Einsatz. 30 min inkubieren.
   3. Während der Inkubation drehen Sie kurz das Anti-CD8, das Programm Zelltodprotein 1 (PD-1) und die Antikörper gegen T-Zell-Immunglobulin und Mucin-haltiges Protein-3 (Tim-3) (Table of Materials). Bereiten Sie die Mischung der primären Antikörper bei TBS vor, wie in Tabelle 2 beschrieben.
4. Immunfärbung für CD8, PD-1 und Tim-3
   1. Bereiten Sie die Primärantikörpermischung vor. In der Materialtabelle und in Tabelle 2 finden Sie die verwendeten Antikörper (Anti-CD8, PD-1, Tim-3 und die entsprechenden Sekundärantikörper) und ihre Konzentrationen.
   2. Tippen und/oder schnippen Sie auf das restliche Eselserum (hinzugefügt in Schritt 1.3.2). Inkubieren Sie die Objektträger mit 100 μl des unmarkierten Primärantikörpermixes für 1 h in einer befeuchteten Kammer.
   3. Während der Inkubation die Cyanin-5-Anti-Kaninchen-, Alexa Fluor 488-Anti-Ziegen- und biotinylierten Anti-Maus-Antikörper kurz drehen und die Mischung aus Sekundärantikörpern wie in Tabelle 2 beschrieben vorbereiten.
   4. Waschen Sie die Objektträger 5 Minuten lang in TBST. Trocknen Sie die Objektträger.
   5. Inkubieren Sie die Objektträger mit 100 μl der Sekundärantikörper für 30 min in einer befeuchteten Kammer.
   6. Bereiten Sie die Mischung aus tertiären Antikörpern vor, die Cyanin-3-Streptavidin enthalten, wie in Tabelle 2 beschrieben.
   7. Waschen Sie die Objektträger 10 Minuten lang in TBS. Trocknen Sie die Objektträger.
   8. Inkubieren Sie die Objektträger mit 100 μl des tertiären Antikörpergemisches für 30 min.
   9. Waschen Sie die Objektträger 10 Minuten lang in TBS. Trocknen Sie die Objektträger.
5. Montage von Zellen
   1. Montieren Sie die Objektträger in ein 4',6-Diamidino-2-phenylindole, Dihydrochlorid (DAPI)-haltiges Eindeckmedium (1,5 μg/mL DAPI) mit einem für die Fluoreszenzmikroskopie kompatiblen Deckglas (siehe Materialtabelle).
      Anmerkung: Als Negativkontrolle für jedes Experiment wurde ein Objektträger mit isotypangepassten Antikörpern in der gleichen Konzentration wie die entsprechenden Antikörper verwendet. Für diese Färbung verwendeten wir Maus-IgG1-, Kaninchen-IgG- und Ziegen-IgG-negative Kontrollantikörper (siehe Materialtabelle). Als Positivkontrolle verwendeten wir für jedes Experiment die humane hyperplastische Mandel, von der bekannt ist, dass sie für die getesteten Marker positiv ist. Eine typische Färbung ist in den Ergebnissen beschrieben (Abbildung 1). Die Monofärbung von CD8, PD-1 und Tim-3 sollte einzeln (eine Färbung pro Objektträger) mit der gleichen Vorbehandlung und ohne DAPI durchgeführt werden. Ein Objektträger unter den gleichen experimentellen Bedingungen ohne Antikörper und nur mit einem DAPI-Einbettmedium sollte ebenfalls durchgeführt werden. Ein Objektträger sollte unter identischen Versuchsbedingungen ohne Antikörper und ohne DAPI abgebildet werden.

>2. Fluoreszenzanalyse und automatisierte Zellzählung

1. Bildaufnahme mit dem automatisierten Mikroskop
   1. Erstellen Sie ein Protokoll.
      1. Schalten Sie die automatisierte Mikroskopsoftware und die Fluoreszenzbeleuchtung ein.
      2. Klicken Sie in der Menüleiste auf "Datei", "Protokoll erstellen", wählen Sie "DAPI", "FITC" und "TRITC".
      3. Klicken Sie auf "Weiter", "Gewebeabschnitt" und dann auf "Weiter", "Protokollname". Wählen Sie einen Namen, z. B. "CD8-PD-1-Tim-3", klicken Sie auf "Weiter" und dann auf "Speichern".
      4. Platzieren Sie eine Folie manuell auf der Bühne.
      5. Klicken Sie in der Menüleiste auf "Setup" und "Einstellungen". Klicken Sie im neuen Fenster auf "Set Home Z".
      6. Passen Sie die Belichtungszeit mit einem Positiv-Kontrollobjektträger an, d. h. einem CD8-, PD-1- und Tim-3-Objektträger, der mit einer DAPI-Probe dreifach gefärbt wurde.
      7. Klicken Sie in der Kontrollleiste auf "Belichtung einstellen".
      8. Passen Sie die Belichtungszeit für jeden Filter an, bis ein ausreichendes, aber nicht sättigendes Signal erhalten wird.
      9. Führen Sie für monochrome Bildgebung die folgenden Schritte aus:
      10. Wählen Sie "Erfassung" und unter "Autofokus" den DAPI-Filter aus.
      11. Verschieben Sie in der "Begrenzung des Scanbereichs" das Objektiv nach oben in die obere linke Ecke der Folie. Klicken Sie auf "Markieren". Machen Sie dasselbe für die untere rechte Ecke.
          Anmerkung: Dieser Schritt grenzt den Bereich der Low-Power-Bildgebung (LP-Bildgebung) bei 4X ab. Achten Sie darauf, die Markierung gut zu platzieren, um alle Muster der Serie zu umgeben.
      12. Führen Sie für High Power (HP)-Imaging die folgenden Schritte aus:
      13. Wählen Sie unter "Autofokus" die Option "DAPI".
      14. Wählen Sie im Bereich "Erfassung" die Optionen "DAPI", "FITC", "Cy3" und "Cy5" aus. Klicken Sie auf "OK". Klicken Sie in der Menüleiste auf "Datei" und "Protokoll speichern".
   2. Scannen Sie die Objektträger.
      1. Laden Sie das Protokoll, indem Sie in der Menüleiste auf "Datei" und "Protokoll laden" klicken. Klicken Sie auf "Start".
      2. Geben Sie "Lab-ID" (Ordnerspeicherort für die Bildspeicherung) ein. Geben Sie die Folien-ID ein, um die Folie zu identifizieren. Klicken Sie auf "Weiter".
      3. Klicken Sie auf "Monochrome Imaging" (um das gesamte Objektträger unter hellem Feldlicht zu scannen und sequenzielle Bilder mit einem 4-fach-Objektiv aufzunehmen).
         Anmerkung: Dadurch entsteht eine Graustufenübersicht der Folie.
      4. Klicken Sie auf "Probe suchen". Wählen Sie den zu scannenden Gewebebereich mit niedriger Auflösung (4x) aus: Halten Sie die Strg-Taste gedrückt und klicken Sie mit dem Cursor auf ein Feld, um Felder auszuwählen oder abzuwählen (Abbildung 2A).
      5. Klicken Sie auf "LP Imaging" (4x Imaging) für die fluoreszierende Rot-Blau-Grün-Bildaufnahme jedes Feldes.
      6. Halten Sie für die HP-Feldauswahl die Strg-Taste gedrückt und klicken Sie mit dem Cursor auf ein Feld, um Felder auszuwählen oder abzuwählen, die dem Gewebebereich entsprechen, der mit hoher Auflösung (20x) gescannt werden soll. Wählen Sie 5 Felder aus (Abbildung 2B).
      7. Klicken Sie auf "HP Imaging" (20x Bildgebung), um eine multispektrale Bildaufnahme jedes Feldes zu erhalten (Abbildung 2C).
      8. Klicken Sie auf "Datenspeicherung", um Bilder in dem zu Beginn ausgewählten Ordner in LabID zu speichern.
         Anmerkung: Der Prozess ist in Abbildung 2 zusammengefasst und veranschaulicht. Für jeden Schritt (Gewebeerkennung, Feldauswahl) kann ein Algorithmus inkrementiert und vom Benutzer trainiert werden, um einen vollautomatischen Scanprozess zu ermöglichen.

Tabelle 1: Pufferzusammensetzung von TBS und TBST. TBS wird für Antikörpermischungen und -verdünnungen verwendet. Bei Waschungen werden alle Schritte mit TBS durchgeführt, mit Ausnahme der Waschungen nach primären Antikörpern, bei denen TBST empfohlen wird.

kg kg

	Tbs	TBST
Tris-HCl	0,05 Mio.	0,05 Mio.
NaCl	0,15 Mio.	0,15 Mio.
Tween 20	-	0,05 %
Ph	7,6	7,6
Präparat	1 Tablette in 500 mL H2O

Tabelle 2: Detaillierte Zusammensetzung der Antikörpermischung für die CD8-PD-1-Tim-3-Immunfluoreszenzfärbung. Für jeden primären, sekundären und tertiären Antikörpermix wird die Verdünnung für das entsprechende TBS-Volumen für ein Gesamtvolumen von 1 ml angegeben. Für einen Objektträger beträgt das Gesamtreaktionsvolumen 100 μL für eine Gewebefläche von 2 cm².

kg kg

Das Volumen des primären Antikörpers			Endgültiges V = 1 ml
Kaninchen Anti-CD8	Maus Anti-PD-1	Ziege Anti-Tim-3	Tbs
1,6 μL	2 μL	30 μL	966,4 μl
Das Volumen des Sekundärantikörpers
Cyan 5 Anti-Kaninchen	Biotinyliertes Anti-Maus-Mittel	Alexa Fluor 488 Anti-Ziege	Tbs
3,3 μl	2 μL	2,5 μL	992,2
Das Volumen des tertiären Antikörpers
	Cy3-markiertes Streptavidin		Tbs
	3,3 μl		996,7

Ergebnisse

Abbildung 1: CD8-PD-1-Tim-3-Immunfärbung auf einem in Mandelparaffin eingebetteten Gewebe. Für die dreifache Immunfärbung wurden in Paraffin eingebettete Gewebeschnitte anstelle von kryokonservierten Schnitten ausgewählt. Nach der Entparaffinierung und Rehydrierung wurde das gleiche Färbeprotokoll angewendet, das zuvor für kryokonservierte Schnitte entwickelt worden war. CD8+ T-Zellen befinden sic...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Vectra 3 Automatisierte quantitative Bildgebung in der Pathologie	Perkin Elmer	CLS142338
inForm Zellanalyse 2.1.	Perkin Elmer	CLS135781
R-Software	https://www.r-project.org
Dakopen Begrenzungsstift	Dako	Nr. 2002
Tris Buffer Kochsalzlösung TBS Tabletten	Takara, Bio Inc.	TAKT9141Z	pH7,6 100 Tabletten
Tris Buffer Kochsalzlösung Tween 20 TBS(+Tween20)	Takara, Bio Inc.	TAKT9142Z	pH 7,6 100 Tabletten
Biotin-Blockierungssystem	Dako	X0590	Avidin 0,1 % und Biotin 0,01 %
Normales Eselserum	Jackson Immunforschung	Tel.: 017-000-001	5% vol./vol. Konzentration
Fluoroshield mit DAPI	Sigma-aldrich	Nr. F6057	Konzentration von 1,5 μg/ml
Knittel Glasdeckglas Deckglas	Knittel Gläser,	100039	24x60 mm 100 Deckgläser
Kaninchen Anti-CD8 Klon P17-V	Novus	NBP1-79055	Verwendung bei 4μg/mL
Maus Anti-PD-1 Klonen NAT	ABCAM	AB52587	Anwendung bei 2 μg/mL
Ziege Anti-Tim-3	Forschung und Entwicklung	Nr. AF2365	bei 3 μg/mL
Kaninchen Anti-PD-L1 Klon SP142	Roche	7309457001	Anwendung bei 1 μg/mL
Maus AF647 beschriftet pan - Keratin Klon C11	Zelluläre Signalübertragung	Artikel-Nr.: 4528	Anwendung bei 0,5 μg/mL
Ziege anti-human gal9	Forschung und Entwicklung	Nr. AF2045	Anwendung bei 0,3 μg/mL
Cyan 5 konjugierter Esel Anti-Kaninchen	Jackson Immunforschung	Tel.: 711-175-152	Anwendung bei 5 μg/mL
Biotinyliertes F(ab'2)-Esel-Anti-Maus-IgG	Jackson Immunforschung	Tel.: 715-066-150	bei 3 μg/mL
Alexa Fluor488 konjugiertes Esel Anti-Ziegen-IgG	ABCAM	AB150133	Anwendung bei 5 μg/mL
Cy3-markiertes Streptavidin	Amersham	PA43001	bei 3 μg/mL
Maus mit Negativkontrolle IgG1	Dako	Nr. X0931	Anwendung bei 2 μg/mL
IgG aus Ziegenserum	Sigma-aldrich	Nr. I5256	bei 3 μg/mL
IgG aus Kaninchenserum	Sigma-aldrich	Nr. I5006	Verwendung bei 4μg/mL