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>1. Zellaussaat und Virusinfektion
- 20–24 h vor der Virusinfektion 5 x 104 von humanen embryonalen Lungenfibroblastenzellen (HEL) oder anderen Zellen, die auf einem 4-Well-11-mm-Objektträger in Wachstumsmedium untersucht werden sollen (Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS)). Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C mit 5 % Kohlendioxid (CO2).
Anmerkung: Jede Vertiefung sollte zum Zeitpunkt der Infektion eine Zellkonfluenz von 70-80 % aufweisen.
- Entfernen Sie am nächsten Tag das Wachstumsmedium und infizieren Sie die Zellen mit Viren in Medium-199 in einem Bereich von 4–10 pfu/Zelle. Inkubieren Sie virusinfizierte Zellen 1 h lang bei 37 °C. Schütteln Sie den Objektträger während der Inkubationszeit weiter.
- Nach der 1-stündigen Inkubation Medium-199 entfernen und mit Wachstumsmedium ergänzen.
Anmerkung: Medikamente, die in verschiedene Infektionsphasen eingreifen, können in diesem Schritt oder vor der Virusabsorption hinzugefügt werden.
- Inkubieren Sie die virusinfizierten Zellen bei 37 °C mit 5 % CO2 für verschiedene Infektionszeiten.
>2. Fixierung und Permeabilisierung
- Waschen Sie die infizierten Zellen zum richtigen Infektionszeitpunkt schnell 3 Mal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und fügen Sie 200 μl 4% Paraformaldehyd hinzu, das frisch in PBS hergestellt wurde. Inkubieren Sie die Zellen 8–10 Minuten lang bei Raumtemperatur, um die Zellen in jeder Vertiefung zu fixieren.
- Aspirieren Sie Paraformaldehyd und waschen Sie die Vertiefungen 3 Mal lang mit 200 μl PBS. PBS nach der 3. Wäsche vollständig absaugen.
- Geben Sie 100 μl 0,2 % nichtionisches Tensid in jede Vertiefung, um die Zellen 5–10 Minuten lang zu permeabilisieren.
- Aspirieren Sie das nichtionische Tensid und waschen Sie die Vertiefungen 3 Mal lang mit 200 μl PBS.
>3. Immunfluoreszenz-Färbung
- PBS vollständig aspirieren und 200 μl Blockierungspuffer (1 % Rinderserumalbumin (BSA) und 5 % Pferdeserum in PBS) in jede Vertiefung geben und 1 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 °C inkubieren.
- Die experimentell bestimmte Konzentration des Primärantikörpers gegen das infizierte Zellprotein 0 (Kaninchen-Anti-ICP0-Polyklonal-Antikörper) in einen Blockierungspuffer geben und den Primärantikörper bei Raumtemperatur für 2 h oder bei 4 °C über Nacht inkubieren.
- 3 mal mit Blockierungspuffer bei 10 min Inkubation waschen. Fügen Sie Alexa 594-konjugierten Ziegen-Anti-Kaninchen-Sekundärantikörper (1:400 verdünnt in Blockpuffer) hinzu und inkubieren Sie die Objektträger 1 h lang bei Raumtemperatur. Waschen Sie dann die Objektträger 3 Mal im Abstand von 10 Minuten mit Blockierpuffer
.
- Zum Schluss waschen Sie den Objektträger einmal mit PBS, um BSA- und Pferdeserumreste zu entfernen.
- Geben Sie einen Tropfen Antifading-Eindeckmittel mit 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) hinzu, um die Folie zu befestigen, und versiegeln Sie sie mit Deckglas mit transparentem Nagellack.
>4. Konfokale Bildgebung
- Stellen Sie mit einem konfokalen Mikroskop die Wellenlänge auf 590–650 nm für Alexa 594 und 410–520 nm für DAPI ein. Wählen Sie ein Bildformat mit 1024 x 1024 und einem Zeilendurchschnitt von 8, um hochauflösende Bilder aufzunehmen.
- Analysieren Sie jede Vertiefung auf dem 4-Well-Objektträger unter einem konfokalen Mikroskop. Erfassen Sie repräsentative Zellbilder unter dem 100X-Objektiv, wie in Abbildung 1 und Abbildung 2 gezeigt.
- Um eine große Anzahl von Zellen zu zählen, nehmen Sie Bilder von aufeinanderfolgenden Feldern unter dem 40X-Objektiv auf.
Anmerkung: Es werden 5-10 Bilder benötigt, um über 200 infizierte Zellen aus jedem Zeitpunkt jeder Infektion anzusammeln.
- Nehmen Sie in jedem Experiment Bilder mit konstanten konfokalen Parametern für alle Proben auf, die verglichen werden müssen.
>5. Analyse der nuklearen vs. zytoplasmatischen Verteilung
- Öffnen Sie ein Projekt mit der konfokalen Anwendungssoftware. Wählen Sie ein Bild aus, aus dem die Zellen für die nukleäre vs. zytoplasmatische Verteilung von ICP0 tabellarisch dargestellt werden müssen.
- Klicken Sie im oberen Menü auf die Registerkarte "Menge" und wählen Sie "ROIs sortieren" aus dem Tools-Menü.
- Zeichnen Sie eine Längslinie quer durch die zu analysierende Zelle, indem Sie im oberen Menü "Linie zeichnen" auswählen.
Anmerkung: Es erscheint ein Histogramm, das die Fluoreszenzintensität entlang der Linie sowohl für ICP0 als auch für DAPI zeigt. Im Histogramm stellt die blaue Linie DAPI-Pixel dar und markiert die Grenze des Zellkerns, während die rote Linie ICP0-Pixel darstellt.
- Legen Sie auf der Grundlage der Hintergrundfärbung einen konstanten Schwellenwert für die ICP0-Intensität fest, um die subzelluläre ICP0-Verteilung in jedem Experiment zu analysieren.
- Wie in Abbildung 2 dargestellt, ist das rote Signal, wenn es im Durchschnitt unter dem Schwellenwert im Kernbereich, aber über dem Schwellenwert jenseits der blauen Grenze liegt, als überwiegend im Zytoplasma lokalisiert, zu kategorisieren.
- Wenn das rote Signal über dem Schwellenwert im gesamten Zellkern und jenseits der Grenze des blauen Signals liegt, gruppieren Sie das rote Signal als Kern plus zytoplasmatische Lokalisation.
- Wenn das rote Signal über der Schwelle im Kern liegt, aber im Durchschnitt außerhalb der Grenze des blauen Signals darunter liegt, gruppieren Sie das rote Signal als Kernlokalisation.
- Tabellarisch darzustellen mehr als 200 infizierte Zellen aus jeder Probe zu unterschiedlichen Infektionszeitpunkten und in einem Balkendiagramm darzustellen, um die ICP0-Bewegung nach Zeit zu veranschaulichen (Abbildung 3).
