Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. Chirurgische Exzision und Gewebevorbereitung
- Euthanasieren Sie die Maus durch intraperitoneale Injektion von 1 ml Tribromethanol (hergestellt gemäß Standardprotokoll; Tabelle der Materialien).
Anmerkung: CO2 -Erstickung sollte in Lungenstudien vermieden werden, da sie Lungenschäden verursachen und die Merkmale und Eigenschaften von Lungenimmunzellen verändern kann. Eine Zervixluxation sollte ebenfalls vermieden werden, da sie zu mechanischen Verletzungen der Lunge führen kann.
- Bringen Sie die Maus für den chirurgischen Eingriff in einen sauberen und speziellen Bereich.
- Stabilisieren Sie die Rückenseite der Maus mit Nadeln oder Klebeband an den vier Extremitäten. Verwenden Sie 70% Ethanol, um die Haut des Bauchbereichs zu desinfizieren.
- Führen Sie einen Hautschnitt durch, vom Hals bis zum Bauch. Entfernen Sie vorsichtig die Haut aus dem Brustbereich.
- Entfernen Sie vorsichtig das Brustbein und die Rippen.
- Spülen Sie die Lunge, indem Sie 10 ml kalte phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) mit einer 18-21-G-Nadel direkt in den rechten Ventrikel injizieren, bis die Lunge vollständig weiß wird.
Entfernen - Sie vorsichtig den Thymus und das Herz, ohne die Lunge zu berühren.
- Die Lunge wird vorsichtig vom umgebenden Gewebe gelöst und in ein Röhrchen mit kaltem Rinderserumalbumin (BSA)-Puffer überführt (Tabelle 1).
Anmerkung: Es sollte versucht werden, das gesamte angrenzende Fett aus der Lunge zu entfernen, bevor die Einzelzellsuspension weiter hergestellt wird, da dies die Messwerte verzerren könnte.
2. Herstellung einer einzelligen Suspension
- Die Lungen in eine leere Petrischale geben und mit zwei feinen Skalpellen zerkleinern. Übertragen Sie alle Teile der gehackten Lunge in ein neues konisches 50-ml-Röhrchen. Verwenden Sie 5 ml Verdauungspuffer, um die Platte zu waschen, und geben Sie ihn in das 50-ml-Röhrchen, das die zerkleinerte Lunge enthält (Tabelle 1).
Anmerkung: Der Aufschlusspuffer sollte unmittelbar vor der Verwendung hergestellt werden. Verwenden Sie 5 mg/ml Kollagenase. Die Kombination von 1 oder 5 mg Kollagenase mit BSA-Puffer oder proteinfreiem PBS verbesserte die Ergebnisse nicht (Abbildung 1).
- Den Deckel des Röhrchens verschließen und die Lunge 30 Minuten lang auf einem Orbitalschüttler bei einer Drehzahl von 150 U/min bei 37 °C verdauen. Stoppen Sie die Reaktion, indem Sie 10 ml kalten BSA-Puffer hinzufügen.
- Nach der Verdauung die Lungenstücke mit einer 18 G Nadel vermischen und auflösen. Setzen Sie ein 70-μm-Filtersieb auf ein neues konisches 50-ml-Röhrchen.
Anmerkung: Die Verwendung eines kleineren Mikronfilters kann zum Verlust wichtiger myeloischer Populationen führen.
- Übertragen Sie die verdaute Lungenmischung langsam direkt auf das Sieb. Verwenden Sie die Gummiseite eines 10-ml-Spritzenkolbens, um die restlichen Lungenteile auf dem Filter zu zerschlagen. Waschen Sie das verarbeitete Material auf dem Filter mit BSA-Puffer.
- Die einzellige Suspension wird bei 350 × g 8 min bei 4 °C zentrifugiert.
- Entsorgen Sie den Überstand vorsichtig und resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml Ammoniumchlorid-Kalium (ACK)-Lysepuffer. Mit einer 1-ml-Pipette gut mischen und 90 s bei Raumtemperatur inkubieren.
- Fügen Sie 10 ml kalten BSA-Puffer hinzu, um die Reaktion zu stoppen, und zentrifugieren Sie bei 350 × g für 7 min bei 4 °C. Entsorgen Sie den Überstand vorsichtig und resuspendieren Sie das Pellet in Färbepuffer, um die Zellen mit einem Hämozytometer zu zählen.
- Die Zellen werden in einer Konzentration von 5 × 106 Zellen/ml resuspendiert und zur Oberflächenfärbung verwendet (siehe Abschnitt 2).
Anmerkung: Zu diesem Zweck werden die Zellen in einer 96-Well-Platte mit rundem Boden plattiert, gefolgt von Antikörperfärbungen und Waschungen. Wenn keine Plattenzentrifuge verfügbar ist, verwenden Sie Durchflussschläuche anstelle von Platten. Mit diesem Protokoll können ~15-20 × 106 Zellen pro Lunge von einer 6-10 Wochen alten C57BL/6-Maus mittlerer Größe gewonnen werden.
>3. Oberflächen-Antikörper-Färbung
- Übertragen Sie 1 × 106 Zellen in 200 μl pro Well in eine 96-Well-Platte. Die Platte bei 350 × g 7 min bei 4 °C zentrifugieren. In der Zwischenzeit wird die Fc-Block-Lösung durch Verdünnen des Anti-16/32-Antikörpers (1:100) in Färbepuffer hergestellt (Tabelle 1).
- Die Zellen werden in 50 μl der vorbereiteten Fc-Blockierungslösung (Table of Materials) resuspendiert und 15-20 min bei 4 °C oder auf Eis inkubiert.
- Fügen Sie 150 μl Färbepuffer hinzu und zentrifugieren Sie die Platte bei 350 × g für 5 min bei 4 °C. In der Zwischenzeit bereiten Sie den Oberflächenantikörper-Cocktail vor, indem Sie Oberflächenantikörper (1:100; Tabelle 2) im Färbepuffer.
HINWEIS: (i) Anti-16/32-Antikörper zur Fc-Blockierung können mit den Oberflächenantikörpern in der gleichen Mischung verwendet werden. ii) Wenn ein fixierbarer Viabilitätsfarbstoff verwendet wird, wird er in einer Verdünnung von 1:1.000 zum Oberflächenantikörpercocktail gegeben.
- Die Zellen werden in 50 μl des vorbereiteten Oberflächen-Antikörper-Cocktails resuspendiert und 30-40 min bei 4 °C im Dunkeln inkubiert. Waschen Sie die Zellen zweimal mit Färbepuffer.
Anmerkung: Wenn keine intrazelluläre Färbung erforderlich ist, resuspendieren Sie die Zellen in 200 μl Färbepuffer und fahren Sie direkt mit der Datenerfassung auf dem Durchflusszytometer fort. Alternativ können die Zellen fixiert und bei 4 °C gelagert werden, um sie später zu erfassen. Wir empfehlen, die Zellen innerhalb von 24 h für die Durchflusszytometrie zu verwenden.
>4. Zellfixierung und intrazelluläre Färbung
- Bereiten Sie den Fixations-/Permeabilisierungspuffer (Fix/Perm-Puffer) vor, indem Sie drei Teile Fixations-/Permeabilisierungskonzentrat und 1 Teil Fixations-/Permeabilisierungsverdünnungsmittel des FoxP3/Transkriptionsfaktor-Färbepuffer-Sets mischen (Tabelle 1).
- Resuspendieren Sie die Zellen in 50 μl des vorbereiteten Fix/Perm-Puffers pro Vertiefung der 96-Well-Platte, auf der die Zellen wie in Abschnitt 3 beschrieben plattiert wurden, und inkubieren Sie sie 20-25 Minuten lang bei 4 °C im Dunkeln.
- Verdünnen Sie den 10x Permeabilisierungspuffer als 1:10 in gereinigtem deionisiertem Wasser, um 1x Permeabilisierungspuffer herzustellen.
- Waschen Sie die Zellen einmal mit 1x Permeabilisierungspuffer. In der Zwischenzeit bereiten Sie den intrazellulären Antikörpercocktail vor, indem Sie intrazelluläre Antikörper (1:100) in 1 ml Permeabilisierungspuffer verdünnen.
- Resuspendieren Sie die Zellen mit 50 μl des vorbereiteten Oberflächen-Antikörpercocktails pro Zelle der 96-Well-Platte und inkubieren Sie 40 Minuten lang bei 4 °C im Dunkeln.
- Waschen Sie die Zellen einmal mit Permeabilisierungspuffer und einmal mit Färbepuffer. Nach der letzten Wäsche resuspendieren Sie die Zellen in 200 μl Färbepuffer.
Anmerkung: Wenn kein Durchflusszytometer mit Plattenlesegerät verfügbar ist, überführen Sie die Zellen in Durchflusszytometrieröhrchen.
- Erfassen Sie mindestens 1,5 × 106 Zellen pro Probe auf dem Durchflusszytometer.
Anmerkung: Für einfarbige und ungefärbte Kontrollproben sind 0,5-1 × 106 Zellen pro Probe ausreichend. Es wird empfohlen, die einzelnen verwendeten Antikörper zu titern, um eine optimale Färbung zu erreichen und die Kosten zu senken. Das vorliegende Protokoll wurde unter Verwendung von Fix/Perm-Puffer optimiert, der mit dem FoxP3-Färbepuffersatz hergestellt wurde. Da es sich bei CD68 um einen zytoplasmatischen und nicht um einen nuklearen Marker handelt, könnten andere Permeabilisierungslösungen wie eine niedrige Konzentration von Paraformaldehyd oder Cytofix/Cytoperm-Kits verschiedener Anbieter ausreichend sein.
Tabelle 1: Puffer.
| BSA-Puffer | PBS + 0,5 % Rinderserumalbumin |
| Aufschluss-Puffer | Vorgewärmter (37 °C) BSA-Puffer + 5 mg/ml Kollagenase Typ 1 + 0,2 mg/ml DNase I |
| Puffer zum Färbemittel | PBS + 2,5 % FBS |
| Fix/Perm-Puffer | Drei Teile Fixierungs-/Permeabilisierungsverdünnungsmittel und 1 Teil Fixierungs-/Permeabilisierungsverdünnungsmittel des Foxp3/Transkriptionsfaktor-Färbepuffer-Sets |
| Permeabilisierungs-Puffer | 10x Permeabilisierungspuffer aus dem Foxp3/Transkriptionsfaktor-Färbepuffer-Set, 10-mal verdünnt in gereinigtem deionisiertem Wasser |
Tabelle 2: Verwendung von monoklonalen Antikörpern.
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| Antigen | klonen | Fluorochrom | Verdünnung | Oberfläche/intrazellulär |
| CD45 | 30-F11 | APC/CY7 | 1:100 | Oberfläche |
| Gr-1 | RB6-8C5 | BV421 | 1:100 | Oberfläche |
| CD68 | FA-11 | PerCPCy5.5 | 1:100 | intrazellulär |
| CD11b | M1/70 | PECy7 | 1:100 | Oberfläche |
| Siglec F | S17007L | FITC | 1:100 | Oberfläche |
| CD11c | Nr. N418 | BV650 oder BV510 | 1:100 | Oberfläche |
| CD64 | X54-5/7.1 | PE/Dazzle 594 | 1:100 | Oberfläche |
| MHC-II | M5/114.15.2 | AF700 | 1:100 | Oberfläche |
| CD103 | 2.00E+07 | PE / FITC | 1:100 | Oberfläche |
| Lebend/tot reparierbar Far Read Dead Cell Stain Kit | | FarRed (APC) oder Aqua (BV510) | 1:1000 | Oberfläche |
| CD3 | 17A2 | Pe | 1:100 | Oberfläche |
| Nr. B220 | RA3-6B2 | Nr. AF488 | 1:100 | Oberfläche |
| NK1.1 | PK136 | FITC | 1:100 | Oberfläche |
| CD24 | 30-F1 | Pe | 1:100 | Oberfläche |
| MERTK | 2B10C42 | Pe | 1:100 | Oberfläche |
| F4/80 | BM8 | BV605 | 1:100 | Oberfläche |
| CX3CR1 | SA011F11 | Pe | 1:100 | Oberfläche |
| FcBlock (CD16/32) | 93 | | 1:100 | Oberfläche |
