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>1. Präparation von Kryptokokkenzellen
- Den Testorganismus mit einer Impfschlaufe auf eine sterile Hefe-Malz-Extrakt (YM)-Agarplatte ausstreichen.
- Inkubieren Sie die Agarplatte bei 30°C für 48 h.
- Verwenden Sie eine Impfschlaufe, um 5 einzelne Kolonien zu schöpfen und sie in 5 ml sterilem destilliertem Wasser zu suspendieren.
- Standardisieren Sie die Zellen mit einem McFarland-Standard, um eine Zellkonzentration zwischen 0,5 × 10,5 und 2,5 × 105 koloniebildenden Einheiten (KBE) pro ml RPMI-1640-Medium zu erhalten.
- Geben Sie eine 100-μl-Zellsuspension in Vertiefungen mit Mikrotiterplatten, die ausgesäte Makrophagen enthalten (siehe Abschnitt unten).
2. Präparation von Makrophagen
- Kultivieren Sie eine murine Makrophagen-Zelllinie, RAW 264.7, auf einem Gewebekolben mit 10 ml RPMI-1640-Medium, ergänzt mit 20 mg/ml Streptomycin, 2 mM L-Glutamin, 20 U/ml Penicillin und 10 % fötalem Rinderserum.
- Den Kolben in einen 5 % CO2 -Inkubator stellen, der auf 37 °C eingestellt ist, bis eine Konfluenz von 80 % erreicht ist.
- Kratzen Sie die Zellen vorsichtig mit einem Zellschaber ab.
- Übertragen Sie die suspendierten Zellen in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen.
- Verwenden Sie den Trypanblau-Farbstoff, um die Zellviabilität zu bestimmen.
Anmerkung: Ein Rentabilitätswert von über 85 % wird bevorzugt.
- Verwenden Sie ein Hämozytometer, um die Zellkonzentration der Makrophagen auf 1 × 106 Zellen/ml einzustellen, indem Sie eine 10-ml-Lösung aus frischem, sterilem RPMI-1640-Medium verwenden.
- Geben Sie 100 μl Suspension von Zellen in Vertiefungen einer sterilen 96-Well-Mikrotiterplatte mit flachem Boden.
- Inkubieren Sie die Platte über Nacht in einem 5 %CO 2 -Inkubator bei 37 °C.
Anmerkung: Vor der Verwendung sollte das über Nacht verbrauchte Medium aspiriert und durch 100 μl frisches, steriles Medium des Roswell Park Memorial Institute-1640 (RPMI-1640) ersetzt werden.
>3. Herstellung von Verbindungen
- Testphotosensibilisatoren und Primaquin (PQ) in destilliertem Wasser auflösen, um eine Stammlösung herzustellen.
- Verdünnen Sie die Verbindung weiter in RPMI-1640-Medien.
Anmerkung: Die endgültige Menge an destilliertem Wasser in RPMI-1640-Medien sollte 1 % nicht überschreiten.
- Geben Sie eine 100-μl-Lösung des vorbereiteten Photosensibilisators ab, um die gewünschte Konzentration zu vervierfachen, in geeignete Vertiefungen, die die bereits ausgesäten Makrophagen und Kryptokokkenzellen enthalten.
>4. Durchführung der photodynamischen Behandlung (PDT)
- Richten Sie die folgenden Versuchsbedingungen ein:
- Co-kultivierte Zellen mit 0 μM PQ, die 2 Minuten lang dunklem Licht (DL) ausgesetzt wurden (d. h. unbehandelte (nicht-Rx) Zellen)
- Co-kultivierte Zellen mit 6 μM und 2 Minuten lang DL ausgesetzt (d. h. Arzneimittelwirkung)
- Co-kultivierte Zellen mit 15 μM PQ und 2 Minuten lang DL ausgesetzt (d. h. Arzneimittelwirkung)
- Co-kultivierte Zellen mit 30 μM PQ und 2 Minuten lang DL ausgesetzt (d. h. Arzneimittelwirkung)
- Co-kultivierte Zellen mit 0 μM PQ und 2 Minuten lang ultraviolett (UV) ausgesetzt (UV-Effekt)
- Co-kultivierte Zellen mit 6 μM PQ und 2 Minuten lang ultraviolettem Licht (UVL) ausgesetzt (d. h. PDT-Effekt)
- Co-kultivierte Zellen mit 15 μM PQ und 2 Minuten lang UVL ausgesetzt (d. h. PDT-Effekt)
- Co-kultivierte Zellen mit 30 μM PQ und 2 Minuten lang UVL ausgesetzt (d. h. PDT-Effekt)
Anmerkung: Die kokultivierten Zellen müssen 30 Minuten lang im Dunkeln mit PQ reagieren (falls zutreffend), bevor sie (falls zutreffend) UVL ausgesetzt werden.
Anmerkung: In der aktuellen Arbeit haben wir festgestellt, dass PQ eine UV/Vis-Absorption von 260 nm aufweist, was im UV-Bereich der keimtötenden Lampe liegt. Aus letzterem Grund haben wir eine keimtötende UVC-Lampe (UVC) verwendet, die in einer biologischen Sicherheitswerkbank der Klasse II als Lichtquelle für die Implementierung der PDT eingebaut ist. Die Lampe soll eine Nennleistung von 30 Watt haben. Die Zellen wurden in der aktuellen Studie in einem Abstand von etwa 20 cm zur Lampe gehalten. Bei dieser Entfernung wird die Lampe auf eine Strahlungsleistung von 625 μW/cm2 geschätzt.
>5. Zählung von Kolonien, um das Überleben von Kryptokokkenzellen zu bestimmen
- Nach Beginn der photodynamischen Behandlung der co-kultivierten Zellen wie oben angegeben, werden die Platten 18 h lang bei 37 °C in 5 % CO2 inkubiert.
- Nach 18 h ist der Überstand zu aspirieren.
- Waschen Sie die Vertiefungen mit 200 μl Phosphatpufferlösung (PBS), um nicht internalisierte Zellen abzuwaschen. Wiederholen Sie diesen Schritt dreimal.
- 300 μl 0,1 % Triton X-100 in die Vertiefungen geben und 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
- Saugen Sie den Inhalt der Vertiefungen ab und geben Sie ihn in sterile 1,5-ml-Kunststoffröhrchen ab.
- Bereiten Sie eine Verdünnung der Zellen im Verhältnis 1 zu 10 mit destilliertem Wasser vor.
Anmerkung: Die Verdünnung wird so eingestellt, dass zwischen 30 und 300 Kolonien auf Agarplatten wiedergewonnen werden können.
- 50 μl der Verdünnung auf eine Hefemalz (YM)-Agarplatte pipettieren.
- Verwende eine Spreizplattenmethode, um einen Zusammenflussrasen aus Zellen auf der Oberfläche der Agarplatte zu erzeugen.
- Inkubieren Sie die Platten bei 30°°C für 48 h.
- Zählen Sie die koloniebildenden Einheiten (KBE), die sich auf den Agarplatten entwickelt haben.