Die Wirkung von Aspirin und Ibuprofen auf die phagozytäre Fähigkeit von Makrophagen

Zusammenfassung

Dieses Video zeigt eine Methode zur Bewertung der Wirkung von Aspirin und Ibuprofen in ihren minimalen inhibitorischen Konzentrationen auf die Makrophagen-Phagozytose unter Verwendung von pH-empfindlichen Fluoreszenzfarbstoff-gefärbten Pilzzellen. Die Medikamente hemmen die Cyclooxygenase-2, verringern die Prostaglandinbildung und verstärken die Makrophagen-Phagozytose, wie durch Fluoreszenzmessungen von pH-empfindlichem Farbstoff beobachtet wurde.

Protokoll

>1. Sicherheitsaspekte

1. Das Personal sollte persönliche Schutzausrüstung (PSA) verwenden.
2. Behandeln Sie den Erreger und die Makrophagen in einer biologischen Sicherheitswerkbank der Klasse II.

2. Präparation von Makrophagen

1. Kultivieren Sie eine murine Makrophagen-Zelllinie, RAW 264.7, in einem Gewebekolben mit 10 ml Roswell Park Memorial Institute-1640 (RPMI-1640) Medium, ergänzt mit 20 mg/ml Streptomycin, 2 mM L-Glutamin, 20 μl/ml Penicillin und 10 % fötalem Rinderserum (FBS).
2. Den Kolben in einen 5%igen Kohlendioxid (_{CO 2})-Inkubator stellen, der auf 37 °C eingestellt ist, bis ein Konfluationsgrad von 80 % erreicht ist.
3. Kratzen Sie die Zellen vorsichtig mit einem Zellschaber ab.
4. Übertragen Sie die suspendierten Zellen in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen.
5. Verwenden Sie den Trypanblau-Farbstoff, um die Zellviabilität zu bestimmen.
   Anmerkung: Ein Viability Score über 85% wird bevorzugt.
   Verwenden Sie ein Hämozytometer, um die Zellkonzentration von Makrophagen auf 1 × 10⁵ Zellen/ml einzustellen, indem Sie eine 10-ml-Lösung aus frischem, sterilem RPMI-1640-Medium verwenden. Geben Sie eine 100-μl-Suspension der Zellen in Vertiefungen einer sterilen 96-Well-Mikrotiterplatte mit flachem Boden. Inkubieren Sie die Platte über Nacht in einem 5 % CO₂ -Inkubator bei 37 °C.
   Anmerkung: Das über Nacht verbrauchte Medium sollte vor der Verwendung aspiriert und durch 100 μl frisches, steriles RPMI-1640-Medium ersetzt werden.

>3. Präparation von Kryptokokkenzellen

1. Den Testorganismus mit einer Impfschlaufe auf eine sterile Hefe-Malz-Extrakt (YM)-Agarplatte ausstreichen.
2. Inkubieren Sie die Agarplatte bei 30°C für 48 h.
3. Beimpfen Sie mit einer Impfschlaufe eine Schlinge voller Zellen in 100 ml Brühe auf Hefestickstoffbasis (YNB), die mit 4 % Glukose ergänzt ist.
4. Züchten Sie die Zellen (Vorkultur) über Nacht unter Schütteln bei 160 U/min bei 30°C.
5. Am nächsten Tag werden 0,1 ml der Vorkultur in frische YNB-Bouillon (Hauptkultur) geimpft und die Zellen bis zur mittleren exponentiellen Phase (unter gleichen Kultivierungsbedingungen) wachsen gelassen.
6. Waschen Sie die Zellen zweimal mit Phosphatpufferlösung (PBS).
7. Standardisieren Sie die Zellen mit einem Hämozytometer auf 1 x 10⁵ in PBS.

>4. Färbung von Kryptokokkenzellen mit dem Phagozytose-Farbstoff

1. Geben Sie 999 μl der Zellen in ein 1,5 mL Kunststoffröhrchen.
2. Geben Sie 1 μl des grünen Zymosan-A-Farbstoffs pHrodo in dasselbe Röhrchen.
3. Inkubieren Sie die Zellen 1 h lang bei Raumtemperatur im Dunkeln unter langsamem Rühren, um mit dem Fleck zu reagieren.
4. Waschen Sie die Zellen am Ende der Inkubationszeit dreimal mit PBS.
5. Geben Sie eine 100-μl-Zellsuspension in Vertiefungen, die ausgesäte Makrophagen enthalten.

>5. Zubereitung von Arzneimitteln

1. Bereiten Sie eine Stamm-Aspirinlösung mit 1 mg Aspirin in 1000 ml absolutem Ethanol bis zu einer Endkonzentration von 1000 μg/ml vor.
2. Verdünnen Sie die Verbindung weiter in RPMI-1640-Medien, um die gewünschten Arzneimittelkonzentrationen zu erreichen.
   Anmerkung: Die endgültige Ethanolmenge in RPMI-1640-Medien sollte 1 % nicht überschreiten. Bereiten Sie eine Stammlösung von Ibuprofen mit 1 mg Ibuprofen in 1000 ml Dimethylsulfoxid (DMSO) vor. Verdünnen Sie die Verbindung weiter in RPMI-1640-Medien, um die gewünschten Arzneimittelkonzentrationen zu erreichen.
   Anmerkung: Die endgültige DMSO-Menge in RPMI-1640-Medien sollte 1 % nicht überschreiten. Bereiten Sie eine 100-μl-Lösung der vorbereiteten Arzneimittel in vierfacher Konzentrationsmenge vor und geben Sie sie in geeignete Vertiefungen, die ausgesäte Makrophagen und Kryptokokkenzellen enthalten.

>6. Die Wirkung von Chemo-sensibilisierenden Mitteln auf die Makrophagen-Phagozytose

1. Inkubieren Sie die Platten mit co-kultivierten Zellen in Gegenwart von chemosensibilisierenden Mitteln, Aspirin oder Ibuprofen in einem 5%igen CO_{2 -}Inkubator bei 37 °C für 2 h oder 6 h.
2. Am Ende der Inkubationszeit ist die induzierte Fluoreszenz zu messen (z. B. 492 nm und em: 538 nm).
   Anmerkung: Die pHrodo-Färbung fluoresziert nur in sauren Umgebungen, wie z. B. im Inneren des Phagosoms.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Agar	Merck		Wird zur Vorbereitung von YM-Platten verwendet
Hefeextrakt	Merck		Wird zur Vorbereitung von YM-Platten verwendet
Malz-Extrakt	Merck		Wird zur Vorbereitung von YM-Platten verwendet
Pepton	Merck		Wird zur Vorbereitung von YM-Platten verwendet
Hefe-Stickstoff-Base (YNB)	Difco Laboratorien		Wird bei der Kultivierung von Kryptokokkenzellen verwendet
Traubenzucker	Merck		Wird zur Vorbereitung von YM-Platten verwendet
Trypanblaue Beize	Sigma-Aldrich		So zählen Sie lebende und tote Zellen auf
Phosphatpufferlösung (PBS)	Sigma-Aldrich		Zellen waschen und verdünnen
RPMI- 1640 mittel	Biochrom		Kultivierungsmedien für Makrophagen
Fötales Rinderserum (FBS)	Biochrom		Wird als Ergänzung zum RPMI-1640 Medium
Penicillin/Streptomycin/L-Glutamin	Sigma-Aldrich		Hinzugefügt zum RPMI-1640 Medium
pHrodo grüner Zymosan A-Fleck	Lebenstechnologien		Wird verwendet, um internalisierte Zellen aufgrund einer Änderung des pH-Werts zu färben
Acetylsalicylsäure (Aspirin)	Sigma-Aldrich		Das Medikament, das getestet werden soll
Absolutes Ethanol	Merk		Wird verwendet, um Aspirin aufzulösen
Ibuprofen	Sigma-Aldrich		Zu testendes Medikament
Dimethylsulfoxid (DMSO)	Merk		Wird verwendet, um Ibuprofen aufzulösen
96-Well-Mikrotiterplatten mit flachem Boden	Greiner Bio-One		Wird als Gefäß verwendet, in dem Reaktionen durchgeführt werden
Tissue-Flasche	Lasec		Wird zur Kultivierung von Makrophagen verwendet
15 mL Zentrifugenröhrchen	Lasec		Wird zur Eindämmung von Makrophagen verwendet
Zellen-Abstreifer	Lasec		Wird verwendet, um Makrophagen aus dem Gewebekolben zu lösen
Impfschlaufe	Lasec		Wird verwendet, um Kultur auf die Agarplatte zu streichen
Hämozytometer	Marienfield		Zur Bestimmung der Zellkonzentration der Makrophagen
1,5 mL Kunststoff-Röhrchen	Merck		Wird als Gefäß verwendet, in dem Reaktionen durchgeführt werden
EZ Read 800 Spektralphotometer für die Forschung	Biochrom		So lesen Sie die optische Dichte
Fluoroskan Ascent FL	Thermo-Scientific		Zur Messung der Fluoreszenz
CO2 -Inkubator	Thermo-Fischer		Wird verwendet, um die Makrophagen zu inkubieren
Biologische Sicherheitswerkbank der Klasse II	ESCO		Um sicher mit den Krankheitserregern zu arbeiten, ohne den Benutzer zu schädigen.

verwendet ab