$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
>1. Vorbereitung von Zielzellen für die Infektion
- Seed-Zielzellen am Tag vor der Durchführung des Experiments in einer 96-Well-Platte (der "Zielplatte").
- Plattieren Sie ausreichend Zellen pro Well, um eine nahezu konfluente (~90%) Monoschicht zu gewährleisten.
Anmerkung: Dies hängt von der relativen Größe des Zielzellentyps ab. Bei Verwendung von humanen Vorhautfibroblasten (HFFs) 20.000 Zellen/Mulde aussäen.
- In der Regel sollten 21 Vertiefungen (7 mal 3 breit) pro Probe ausgesät werden, so dass 4 Proben pro Platte analysiert werden können.
- Säen Sie weitere 12 Vertiefungen pro Platte (d. h. Reihe 8), die als Kontrollen dienen.
>2. Vorbereitung des Virus: Antikörpermischungen
- 90 μl Medium in Kombination mit Antikörper (und gut gemischt) geben, um das Doppelte der gewünschten anfänglichen Testantikörperkonzentration in 3 Vertiefungen in Reihe 1 einer frischen 96-Well-Platte (die "Verdünnungsplatte") zu erzeugen.
Anmerkung: Eine typische Ausgangskonzentration von Antikörpern liegt bei 20 μg/ml, sollte aber empirisch bestimmt werden.
- Geben Sie 60 μl Medium in jede der 18 Vertiefungen unterhalb der 3 Vertiefungen aus Schritt 2.1 (d. h. 6 mal 3 nach unten).
- Geben Sie 60 μl Medium in 12 zusätzliche Vertiefungen (d. h. Reihe 8).
- 30 μl Antikörperverdünnung aus Reihe 1 in die entsprechenden Vertiefungen in Reihe 2 übertragen.
- Mischen Sie den Inhalt von Reihe 2, indem Sie mit der Mehrkanalpipette 20 Mal sanft auf und ab pipettieren.
- 30 μl Antikörperverdünnung von Reihe 2 auf Reihe 3 übertragen.
- Wiederholen Sie diesen Vorgang des Mischens und Umfüllens, bis der Inhalt von Reihe 7 vermischt ist.
- Nach dem Mischen von Reihe 7 werden 30 μl aus den Vertiefungen in Reihe 7 entsorgt.
- HCMV wird in einem vollständigen Medium so verdünnt, dass 50 μl genügend infektiöse Partikel enthalten, um eine MOI=1-Infektion zu verursachen, wenn es direkt in die Zellen gegeben wird.
Anmerkung: HCMV ist ein Krankheitserreger der Biosicherheitsstufe 2 (BSL-2). Stellen Sie sicher, dass geeignete Sicherheitsverfahren vorhanden sind, und verwenden Sie Filterspitzen für alle HCMV-exponierten Medien.
Anmerkung: Dies erfordert die gleiche Anzahl an infektiösen Partikeln wie Zellen/Vertiefungen, die je nach Zelltyp und Virustropismus variieren. Bei Verwendung von HFFs wie oben beschrieben, beträgt die erforderliche Viruskonzentration 4x105 pfu/ml.
Anmerkung: Stellen Sie sicher, dass ein ausreichender Überschuss an verdünntem Virus (z. B. 10 % extra) vorbereitet ist.
- Geben Sie 60 μl verdünntes Virusmaterial in alle Vertiefungen, die Antikörperverdünnungen enthalten, und 6 Vertiefungen, die nur 60 μl Medien enthalten.
- Geben Sie nur 60 μl Medium in die verbleibenden 6 Vertiefungen des Mediums, um als nicht infizierte Kontrollen zu dienen.
- Inkubieren Sie das resultierende Virus: Antikörpermischungen bei 37°C für 1 h.
>3. Infektion von Zielzellen
- Entfernen Sie alle Medien aus den Zielzellen.
- Mit einer Mehrkanalpipette werden 100 μl Virus: Antikörpergemisch von der "Verdünnungsplatte" auf die Zellen in der entsprechenden Position auf der "Zielplatte" übertragen.
- Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C, 5 % CO2 für 24 h.
4. Fixierung von Zellen
- Entfernen Sie alle Medien aus den Zellen.
Anmerkung: Zu diesem Zeitpunkt ist es nicht erforderlich, die Spitzen zwischen den Brunnen zu wechseln.
- Waschen Sie alle Vertiefungen mit 200 μl phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und entfernen Sie sie.
- 180 μl -20 °C, 100 % Ethanol in alle Vertiefungen geben.
- Inkubationsplatte bei -20 °C für mindestens 30 min.
Anmerkung: Dieser Schritt kann auf mindestens einen Monat verlängert werden, sofern zusätzliches Ethanol hinzugefügt wird, wenn es zu verdampfen beginnt.
Anmerkung: Die Platte ist ab diesem Zeitpunkt unter BSL-1-Bedingungen sicher zu handhaben, und es können Spitzen ohne Filter verwendet werden.
>5. Nachweis von viral infizierten Zellen durch Immunfluoreszenz (IF)
- Ethanol von der Platte nehmen.
- Alle Vertiefungen mit 200 μL PBS waschen und herausnehmen.
- 200 μl PBS in alle Vertiefungen geben und 5 Minuten inkubieren.
- Bereiten Sie in der Zwischenzeit die primäre Antikörperverdünnung in PBS vor.
- Pro Vertiefung sind 100 μl monoklonales Maus-Anti-IE im Maßstab 1:2000 erforderlich (beachten Sie, dass die Verdünnung für den spezifischen Antikörper gilt, der in den Materialien aufgeführt ist).
HINWEIS: Die Verdünnung des für IF verwendeten Antikörpers muss möglicherweise optimiert werden, wenn eine Alternative verwendet wird.
- Vortex-Mischung, um eine ausreichende Durchmischung zu gewährleisten.
- Entfernen Sie PBS aus allen Vertiefungen und fügen Sie 100 μl Primärantikörperverdünnung hinzu.
1 - h bei Raumtemperatur inkubieren.
- Entfernen Sie den primären Antikörper aus allen Vertiefungen.
- 200 μl PBS zugeben und 5 min inkubieren.
- Bereiten Sie in der Zwischenzeit eine Verdünnung mit Sekundärantikörpern und 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) in PBS vor.
- Pro Vertiefung werden 100 μl 1:2000 Fluorophor-konjugiertes Anti-Maus-IgG und 1 μg/ml DAPI benötigt.
- HINWEIS: Die Verdünnung des für IF verwendeten Sekundärantikörpers muss möglicherweise optimiert werden, wenn eine Alternative verwendet wird.
- Vortex-Mischung, um eine ausreichende Durchmischung zu gewährleisten.
- Entfernen Sie PBS aus allen Vertiefungen und fügen Sie 100 μl Sekundärantikörper/DAPI-Verdünnung hinzu.
- Die Platte 1 h lang bei Raumtemperatur vor Licht geschützt inkubieren.
- Entfernen Sie den Sekundärantikörper/DAPI aus allen Vertiefungen.
- Alle Vertiefungen mit 200 μL PBS waschen und herausnehmen.
- 200 μl PBS in alle Vertiefungen geben und 5 Minuten inkubieren.
- Entfernen Sie PBS und geben Sie 100 μl PBS in alle Vertiefungen und lagern Sie es lichtgeschützt bei 4 °C, bis es für das Bild bereit ist.
Anmerkung: Die Platten können bis zu einem Monat lang mit minimalem Verlust an Signal-/Bildqualität gelagert werden.
>6. Bildgebung und Zählung infizierter Zellen
- Um die Infektion einfach und genau zu quantifizieren, bilden Sie mindestens 25 % jeder Vertiefung ab, sowohl im blauen (DAPI, Zellkerne) als auch im sekundären Antikörperkanal (HCMV-Sofort-Frühe Proteine (IE)).
Anmerkung: Das von der IE-Immunfluoreszenz erzeugte Signal sollte dem der Kernfärbung ähneln, und Bilder sollten überprüft werden, um dies zu bestätigen.
- Dies kann manuell durchgeführt werden, es wird jedoch die Verwendung eines automatisierten Mikroskops empfohlen.
Anmerkung: Die Vergrößerung hängt von Ihrem Instrument ab, aber da große Strukturen (Kerne) abgebildet werden, sind 4X/10X-Objektive in der Regel ausreichend.
- Sobald die Bilder erfasst sind, verarbeiten Sie sie mit dem Software-Analyseprogramm Ihrer Wahl.
- Identifizieren Sie zunächst die Zellkerne über den blauen Kanal, um die Anzahl der vorhandenen Zellen zu berechnen.
- Nur diese Bereiche müssen dann auf Signale im roten Kanal überprüft werden, da IE ein nuklear lokalisiertes Protein ist, um die Anzahl der infizierten Zellen zu berechnen.
- Nachdem die Anzahl der infizierten Zellen und die Gesamtzahl der Zellen berechnet wurden, berechnen Sie den Prozentsatz der Infektion pro Well.
- Diese Werte können für die Hintergrundnachweise korrigiert werden, indem der durchschnittliche Prozentsatz der Infektionen, die in nicht infizierten Vertiefungen beobachtet wurden, von allen anderen Vertiefungen subtrahiert wird.
Anmerkung: Dieser dürfte deutlich unter 1 % liegen. Liegt sie bei mehr als 1 %, muss das Analyseverfahren optimiert werden.
- Diese hintergrundkorrigierten Werte können nun nach Belieben geplottet, abgefragt und analysiert werden.