Quantitativer Multiplex-Bakteriennachweis mit Farbstoff-markierten magnetischen Mikrosphären

Zusammenfassung

Dieses Video demonstriert den quantitativen Multiplex-Bakteriennachweis mit carboxylierten magnetischen Polystyrol-Mikrosphären, die in unterschiedliche Sätze eingefärbt sind. Das Verfahren umfasst die Bildung von Kügelchen-Bakterien-Komplexen, die magnetische Trennung und die flussbasierte Analyse, die eine präzise und gleichzeitige Quantifizierung mehrerer Bakterien in derselben Reaktionsvertiefung ermöglicht.

Protokoll

1. Kovalente Kopplung von Capture-Antikörpern an MagPlex-Mikrosphären

Jeder Einfangantikörper wird mit einem zweistufigen Verfahren wie unten beschrieben an ein spezifisches carboxyliertes magnetisches Mikrosphären-Set konjugiert.

HINWEIS: Ein Kupplungskit mit allen Reagenzien, Puffern und Materialien, die für die Mikrosphärenkopplung erforderlich sind, ist ebenfalls erhältlich (siehe MATERIALTABELLE).

1. Resuspendieren Sie die serienmäßige entkoppelte Mikrosphärensuspension gemäß den Anweisungen im Produktinformationsblatt, das Ihren Mikrosphären beiliegt.
   Anmerkung: Die Anweisungen zur Resuspension hängen von der Größe und dem Volumen Ihrer Standard-Mikrosphärenfläschchen ab.
2. 2,5 x 10⁶ der vorrätigen Mikrosphären werden in ein empfohlenes Mikrozentrifugenröhrchen überführt (siehe MATERIALTABELLE).
3. Legen Sie das Röhrchen in einen Magnetabscheider und lassen Sie die Trennung 60 Sekunden lang erfolgen.
4. Während sich das Rohr noch im Magnetabscheider befindet, entfernen Sie den Überstand.
   Anmerkung: Achten Sie darauf, die Mikrosphären nicht zu stören.
5. Nehmen Sie das Röhrchen aus dem Magnetabscheider und resuspendieren Sie die Mikrokugeln in 100 μL dH₂O durch Wirbel und Beschallung für 20 Sekunden.
6. Wiederholen Sie die Schritte 3 und 4.
7. Nehmen Sie das Röhrchen aus dem Magnetabscheider und resuspendieren Sie die gewaschenen Mikrokügelchen 80 μl 0,1 M Natriumphosphat einbasisch, pH 6,2 durch Wirbel und Beschallung für 20 Sekunden.
8. 10 μl 50 mg/ml N-Hydroxysulfosuccinimid (Sulfo-NHS) (verdünnt in 0,1 M monobasischem Natriumphosphat, pH 6,2) zu den Mikrosphären geben und vorsichtig durch einen Wirbel mischen.
9. 10 μl 50 mg/ml 1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimidhydrochlorid (EDC) (verdünnt in 0,1 M monobasischem Natriumphosphat, pH 6,2) zu den Mikrosphären geben und vorsichtig durch einen Wirbel mischen.
10. 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren und durch Vortex im Abstand von 10 Minuten sanft mischen.
11. Legen Sie das Röhrchen in einen Magnetabscheider und lassen Sie die Trennung 60 Sekunden lang erfolgen.
12. Während sich das Rohr noch im Magnetabscheider befindet, entfernen Sie den Überstand.
    Anmerkung: Achten Sie darauf, die Mikrosphären nicht zu stören.
13. Nehmen Sie das Röhrchen aus dem Magnetabscheider und resuspendieren Sie die Mikrosphären in 250 μl phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), pH 7,4 durch Wirbel und Beschallung für ca. 20 Sekunden.
14. Legen Sie das Röhrchen in einen Magnetabscheider und lassen Sie die Trennung 60 Sekunden lang erfolgen.
15. Während sich das Rohr noch im Magnetabscheider befindet, entfernen Sie den Überstand.
    Anmerkung: Achten Sie darauf, die Mikrosphären nicht zu stören.
16. Wiederholen Sie die Schritte 13-15 für insgesamt zwei Wäschen.
17. Nehmen Sie das Röhrchen aus dem Magnetabscheider und resuspendieren Sie die aktivierten und gewaschenen Mikrosphären in 100 μl PBS, pH 7,4 durch Vortex und Beschallung für ca. 20 Sekunden.
18. Geben Sie 12,5 μg Capture-Antikörper zu den resuspendierten Mikrosphären (d. h. 5 μg/1 Million Mikrosphären).
    Anmerkung: Monoklonale Antikörper werden für die Abscheidung bevorzugt, aber auch polyklonale Antikörper können verwendet werden.
    HINWEIS: 5 μg Protein pro 1 Million Beads sind in der Regel gut, aber wir empfehlen, die Menge zu titrieren, um eine optimale Assay-Leistung zu erzielen.
19. Bringen Sie das Gesamtvolumen auf 500 μl mit PBS, pH 7,4.
20. Mischkupplungsreaktion durch einen Wirbel.
21. 2 Stunden unter Mischen durch Rotation bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren.
22. Legen Sie das Röhrchen in einen Magnetabscheider und lassen Sie die Trennung 60 Sekunden lang erfolgen.
23. Das Rohr befindet sich noch im Magnetabscheider und entfernt den Überstand.
    Anmerkung: Achten Sie darauf, die Mikrosphären nicht zu stören.
24. Nehmen Sie das Röhrchen aus dem Magnetabscheider und resuspendieren Sie die gekoppelten Mikrosphären in 1 ml PBS, pH 7,4 mit 0,02 % Tween-20, 0,1 % Rinderserumalbumin (BSA) und 0,05 % Natriumazid (PBS-TBN) durch Vortex und Ultraschall für 20 Sekunden.
25. Legen Sie das Röhrchen in einen Magnetabscheider und lassen Sie die Trennung 60 Sekunden lang erfolgen.
26. Während sich das Rohr noch im Magnetabscheider befindet, entfernen Sie den Überstand.
    Anmerkung: Achten Sie darauf, die Mikrosphären nicht zu stören.
27. Wiederholen Sie die Schritte 24-26 für insgesamt zwei Wäschen.
28. Nehmen Sie das Röhrchen aus dem Magnetabscheider und resuspendieren Sie die gekoppelten Mikrosphären in 500 μl PBS-TBN.
    Anmerkung: Bestimmen Sie die Anzahl der gewonnenen Mikrosphären mit einem Zellzähler oder Hämozytometer.
29. Gekoppelte Mikrosphären gekühlt bei 2-8°C im Dunkeln lagern.
    Anmerkung: Ein Protokoll zur Bestätigung der Kopplungseffizienz ist ebenfalls verfügbar.

2. Biotin-Markierung von Nachweis-Antikörpern

1. Die Nachweisantikörper wurden unter Verwendung von EZ-Link Sulfosuccinimidyl-6-(Biotinamido)-Hexanoat gemäß den Anweisungen des Herstellers mit einem 20-fachen molaren Überschuss an Biotin-Reagenz biotinmarkiert, um 4-6 Biotingruppen pro Antikörpermolekül zu erreichen.
   Anmerkung: Polyklonale Antikörper werden in der Regel für den Nachweis verwendet, aber auch monoklonale Antikörper können verwendet werden, wenn sie für ein anderes Epitop als den Capture-Antikörper spezifisch sind.
   Anmerkung: Alternativ können kommerziell erhältliche biotinylierte Antikörper zum Nachweis verwendet werden.

>3. Nachweis von Organismen durch Multiplexed Capture Sandwich Immunoassay

Die gekoppelten Mikrosphärensätze und markierten Detektionsantikörper, die in 1 und 2 oben erzeugt wurden, werden in einem Multiplex-Capture-Sandwich-Immunoassay verwendet, um die in einer Probe vorhandenen Bakterien nachzuweisen und zu quantifizieren. Eine Übersicht über den Arbeitsablauf der Assays ist in Abbildung 1 dargestellt.

1. Wählen Sie die Vorratsfläschchen mit antikörpergekoppelten MagPlex-Bead-Sets aus einer Lagerung von 2 bis 8 °C.
2. Vortex und Beschallung für 20 Sekunden.
3. Bereiten Sie eine funktionierende Multiplex-Bead-Mischung so vor, dass jedes Bead-Set eine Endkonzentration von 2500 Mikrokugeln pro 50 μl für jede Reaktionsvertiefung (50.000 Beads/Set/ml) in PBS-TBN.
   Anmerkung: Verwenden Sie eine Tabelle, um die Vorbereitungsparameter für die Arbeitsraupenmischung zu bestimmen.
   Anmerkung: Interne Kontrollkügelchen (RP1 Monitor-Mikrosphären) können ebenfalls enthalten sein, um die Leistung des Assays und des Geräts zu überwachen.
4. Pipettieren Sie 50 μl der Arbeitsperlenmischung in die entsprechenden Vertiefungen einer 96-Well-Platte.
5. Pipettieren Sie 50 μl des Standards oder der Probe in geeignete Vertiefungen.
6. Pipettieren Sie 50 μl PBS-TBN in jede Vertiefung des Hintergrunds.
7. Decken Sie die Platte mit einer Folienversiegelung ab, um die Kügelchen vor Licht zu schützen, und inkubieren Sie auf einem Plattenschüttler bei Raumtemperatur 1 Stunde lang unter Schütteln bei 800 U/min.
8. Legen Sie die Platte 1 Minute lang auf einen magnetischen Plattenseparator.
9. Halten Sie die Platte auf dem magnetischen Plattentrenner, entfernen Sie vorsichtig die Folie und drehen Sie die Platte um, um die Vertiefungen zu entleeren, und klopfen Sie dann zum Trocknen 3-4 Mal auf eine dicke Schicht Laborpapiertücher.
   Anmerkung: Alternativ können Sie die Wells manuell mit einer Mehrkanalpipette absaugen oder eine automatisierte Plattenreinigungsmaschine verwenden.
10. Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um 200 μl PBS-TBN in jede Vertiefung zu geben und 1 Minute lang auf einem Plattenschüttler bei 800 U/min zu schütteln.
11. Legen Sie die Platte 1 Minute lang auf einen magnetischen Plattenseparator.
12. Halten Sie die Platte auf dem magnetischen Plattenabscheider, drehen Sie die Platte um, um die Vertiefungen zu entleeren, und klopfen Sie dann zum Trocknen 3-4 Mal auf eine dicke Schicht Laborpapiertücher.
    Anmerkung: Alternativ können Sie die Wells manuell mit einer Mehrkanalpipette absaugen oder eine automatisierte Plattenreinigungsmaschine verwenden.
13. Wiederholen Sie die Schritte 10-12 für insgesamt zwei Wäschen.
    Anmerkung: Entfernen Sie so viel Puffer wie möglich, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren, um eine mögliche Verdünnung der Reaktion zu vermeiden.
14. Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um 50 μl Assay-Puffer in jede Vertiefung zu geben und 1 Minute lang auf einem Plattenschüttler bei 800 U/min zu schütteln.
15. Verdünnen Sie den biotinylierten Nachweisantikörper auf 4 μg/ml in PBS-TBN.
16. Geben Sie 50 μl des verdünnten Nachweisantikörpers in jede Vertiefung.
17. Decken Sie die Platte mit einer Folienversiegelung ab, um die Kügelchen vor Licht zu schützen, und inkubieren Sie auf einem Plattenschüttler bei Raumtemperatur 1 Stunde lang unter Schütteln bei 800 U/min.
18. Legen Sie die Platte 1 Minute lang auf einen magnetischen Plattenseparator.
19. Halten Sie die Platte auf dem magnetischen Plattenabscheider, drehen Sie die Platte um, um die Vertiefungen zu entleeren, und klopfen Sie dann zum Trocknen 3-4 Mal auf eine dicke Schicht Laborpapiertücher.
    Anmerkung: Alternativ können Sie die Wells manuell mit einer Mehrkanalpipette absaugen oder eine automatisierte Plattenreinigungsmaschine verwenden.
20. Waschen Sie jede gut zweimal nach dem in den Schritten 10-12.
    beschriebenen Verfahren Anmerkung: Entfernen Sie so viel Puffer wie möglich, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren, um eine mögliche Verdünnung der Reaktion zu vermeiden.
21. Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um 50 μl Assay-Puffer in jede Vertiefung zu geben und 1 Minute lang auf einem Plattenschüttler bei 800 U/min zu schütteln. Streptavidin, R-Phycoerythrin-Konjugat (SAPE).
22. Verdünnen Sie den SAPE-Reporter auf 4 μg/ml in Assay-Puffer.
23. Geben Sie 50 μl des verdünnten SAPE in jede Vertiefung.
24. Decken Sie die Platte mit einem Foliensiegel ab, um die Kügelchen und SAPE vor Licht zu schützen, und inkubieren Sie auf einem Plattenschüttler bei Raumtemperatur 30 Minuten lang unter Schütteln bei 800 U/min.
25. Legen Sie die Platte 1 Minute lang auf einen magnetischen Plattenseparator.
26. Halten Sie die Platte auf dem magnetischen Plattenabscheider, drehen Sie die Platte um, um die Vertiefungen zu entleeren, und klopfen Sie dann zum Trocknen 3-4 Mal auf eine dicke Schicht Laborpapiertücher.
    HINWEIS: Alternativ können Sie die Wells manuell mit einer Mehrkanalpipette aspirieren oder eine automatische Plattenwaschmaschine verwenden.
27. Waschen Sie jede gut zweimal nach dem in den Schritten 10-12 beschriebenen Verfahren.
28. Geben Sie 100 μl PBS-TBN in jede Vertiefung und schütteln Sie sie 1 Minute lang auf einem Plattenschüttler bei 800 U/min.
29. Analysieren Sie 50 μl jeder Reaktion auf dem Luminex-Analysator (gemäß dem Benutzerhandbuch für den verwendeten Analysator) und sammeln Sie mindestens 50 Kügelchen pro Beadsset für die Analyse. Im Folgenden finden Sie eine kurze Beschreibung des xMAP INTELLIFLEX®.
    1. Wählen Sie das Dropdown-Menü in der oberen linken Ecke des Bildschirms aus und navigieren Sie zu Plattenkonfiguration.
    2. Wählen Sie Run Plate aus.
    3. Wählen Sie das Symbol Auswerfen, um den Plattenträger auszuwerfen.
    4. Legen Sie die Platte auf den Plattenträger und wählen Sie das Symbol Einfahren, um den Plattenträger einzufahren.
    5. Wählen Sie das Symbol Ausführen aus, um die Platte auszuführen.

Ergebnisse

Abbildung 1: Arbeitsablauf für Multiplex-Capture-Sandwich-Immunoassays. Eine Multiplexmischung aus Antikörper-gekoppelten Mikrosphären wird in jede Vertiefung gegeben und die Probe wird hinzugefügt. Nach einer 1-stündigen Inkubation werden die Reaktionen gewaschen und die biotinylierten Nachweisantikörper hinzugefügt. Nach einer 1-stündigen Inkubation werden die Reaktionen erneut ...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
MagPlex® Mikrosphären	Luminex®	MC100xx-YY	Einzelne Katalognummern (https://www.luminexcorp.com/magplex-microspheres/#order) finden Sie auf der Website
1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen	Eppendorf™	22431081	Eiweiß LoBind®
0,1 M monobasisches Natriumphosphat (NaH2PO4), pH 6,2	MilliporeSigma	Nr. S3139	Aktivierungs-Puffer
1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimidhydrochlorid (EDC)	Thermo Scientific™	Pierce™ 77149
N-Hydroxysulfosuccinimid (Sulfo-NHS)	Thermo Scientific ™	Durchstechen™ 24510
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), pH 7,4	MilliporeSigma	Nr. P3813	Kupplung Puffer
xMAP® Antikörper-Kopplungskit	Luminex®	Tel.: 40-50016	Optionales Kit für die Mikrosphärenkopplung erhältlich.
Anti-Escherichia coli O157:H7 Antikörper	SeraCare	Artikel-Nr.: 5310-0326	Polyklonal, wird sowohl für die Erfassung als auch für die Detektion verwendet
Anti-Salmonella CSA-Plus Antikörper	SeraCare	Artikel-Nr.: 5310-0321	Polyklonal, wird sowohl für die Erfassung als auch für die Detektion verwendet
Anti-Campylobacter spp. Antikörper	SeraCare	Artikel-Nr.: 5310-0324	Polyklonal, wird sowohl für die Erfassung als auch für die Detektion verwendet
Anti-Listeria-Antikörper	SeraCare	Tel.: 5310-0319	Polyklonal, gattungsspezifisch, sowohl für den Fang als auch für den Nachweis
PBS, pH 7,4 mit 0,02 % Tween-20, 0,1 % BSA, 0,05 % Natriumazid (PBS-TBN)	MilliporeSigma	P3563 A7888 Nr. S8032	Bis zu 1% BSA kann verwendet werden
Anti-Escherichia coli O157:H7 Antikörper	SeraCare	Artikel-Nr.: 5310-0326	Polyklonal
(EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin) (Pierce).	Thermo Scientific™	Nr. A39257
E. coli O157:H7	SeraCare	Artikel-Nr.: 5370-0013	Hitzeabgetötet
Salmonellen Serotyp Typhimurium	SeraCare	Artikel-Nr.: 5370-0002	Hitzeabgetötet
Campylobacter jejuni	SeraCare	Artikel-Nr.: 5370-0011	Hitzeabgetötet
Listerien Monozytogene	SeraCare	Artikel-Nr.: 5370-0010	Hitzeabgetötet
Streptavidin, R-Phycoerythrin-Konjugat (SAPE)	Thermo Scientific™	Nr. S866