Isolierung und Verdauung neutrophiler Proteine

Zusammenfassung

Dieses Video zeigt die Proteinisolierung aus Neutrophilen, die weiterverarbeitet und in kleinere Peptide verdaut wird. Diese Peptide können für zukünftige Analysen verwendet werden.

Protokoll

>1. Entnahme und Lyse von Neutrophilenzellen

1. Sammeln Sie neutrophilendifferenzierte HL60-Zellen in einem 15-ml-Röhrchen, indem Sie Proben bei 400 x g für 5 Min. zentrifugieren.
   Anmerkung: Neutrophile Zellen sollten nach der Differenzierung eine Konfluenz von 3,5 x 10⁵ Zellen/ml aufweisen. Ernten Sie etwa fünf Millionen Zellen für die vollständige Proteomextraktion.
2. Entsorgen Sie den Überstand und geben Sie 15 ml phosphatgepufferte Lösung (PBS) in das Röhrchen.
3. Zentrifugieren Sie die Proben bei 400 x g für 5 min.
4. Wiederholen Sie die Schritte 1.2 bis 1.3.
   Anmerkung: Zellproben können mit flüssigem Stickstoff schockgefroren und nach Schritt 1.4 bei -80 °C gelagert werden, abhängig vom experimentellen Zeitrahmen.
5. Zu jeder Probe werden 300 μl kaltes 100 mM Tris (Hydroxymethyl)-aminomethanhydrochlorid (Tris-HCl) mit einem pH-Wert von 8,5 mit einer Proteinase-Hemmer-Cocktail-Tablette (PIC) gegeben.
6. Vortex-Proben kurz.
7. 1/10 Volumen von 20 % SDS zu einer Endkonzentration von 2 % SDS hinzufügen.
8. Um Zellproben zu lysieren, sondieren Sie die Sonde in einem Eisbad für 30 Sekunden an und 30 Sekunden aus für fünf Zyklen bei 10 % Leistung.
9. Zentrifugieren Sie die Proben mit einer kurzen Drehung (maximale Geschwindigkeit für 5-10 Sekunden).
   Anmerkung: Lassen Sie die Zelltrümmer nicht pelletieren. Mit einer kurzen Drehung das Spray von den Tubenwänden auffangen.
10. Übertragen Sie die Proben aus dem 15-ml-Röhrchen in ein 2-ml-Röhrchen.
11. 1/10 Volumen von 1 M Stammdithiothreitol (DTT) zu einer Endkonzentration von 10 mM DTT hinzufügen.
12. Vortex-Proben kurz.
13. Inkubieren Sie die Proben 10 Minuten lang unter Schütteln bei 800 U/min bei 95 °C.
14. Nach 10 Minuten kühlen Sie die Proben auf Raumtemperatur ab.
    Anmerkung: Die Proben können in Eis gelegt werden, um den Abkühlprozess zu beschleunigen.
15. 1/10 Volumen von 0,55 mM Iodacetamid (IAA) zu einer Endkonzentration von 55 mM IAA hinzufügen.
    Anmerkung: Führen Sie Schritt 1.15 im Dunkeln durch, um IAA nicht dem Licht auszusetzen.
16. Vortex-Proben kurz.
17. Inkubieren Sie die Proben bei Raumtemperatur für 20 Minuten im Dunkeln.
18. 100 % eiskaltes Aceton mit einer Endkonzentration von 80 % zugeben und die Proben über Nacht bei -20 °C lagern.
    Anmerkung: Die Lagerung bei -20 °C kann bei Bedarf bis zu zwei Wochen erfolgen.

>2. Verdauung von neutrophilen Proteinen

1. Zentrifugieren Sie Proben bei 13.500 U/min bei 4 °C für 10 Minuten, um Zellpellets auszufällen.
2. Überstand entsorgen und Küvettenpellets mit 500 μl 80 % eiskaltem Aceton waschen.
3. Zentrifugieren Sie die Proben 10 Minuten lang bei 13.500 U/min bei 4 °C und entfernen Sie den Überstand.
4. Wiederholen Sie die Schritte 2.1 bis 2.3.
5. Pellets an der Luft trocknen.
6. Nach dem Trocknen 100 μl 8 M Harnstoff/40 mM 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethensulfonsäure (HEPES) zu den Zellpellets geben und in einem 4 °C warmen Wasserbad für 30 Sekunden ein- und ausschalten, für 15 Zyklen, um Proteinpellets aufzulösen.
7. Unter Verwendung eines Tryptophan-Assays mit Rinderserumalbumin (BSA) (oder einem gleichwertigen Assay) wird die Proteinkonzentration gemäß den Anweisungen des Herstellers quantifiziert.
8. 300 μl Ammoniumbicarbonat (ABC) zugeben, um die Probe auf eine Endkonzentration von 2 M Harnstoff zu verdünnen.
9. Um 50 μg Protein zu verdauen, geben Sie 1:50 Trypsin/LysC (Enzym-zu-Protein-Verhältnis) zu den Proben auf Eis – mischen Sie die Proben durch vorsichtiges Klopfen.
10. Inkubieren Sie die Proben über Nacht bei Raumtemperatur, um den Aufschluss durchzuführen.

Ergebnisse

Abbildung 1. Arbeitsablauf von HL60-Zellen zur Differenzierung in Neutrophile für die massenspektrometrische Proteomik-Profilierung. Undifferenzierte und differenzierte (mittels chemischer DMSO-Stimulation) HL60-Zelllinien wurden kultiviert, gesammelt und für die Totalproteomextraktion verarbeitet. Die Proteine wurden mit Trypsin/LysC verdaut und die Peptide mit C18 STAGE-Tips aufgereinigt, gefolg...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
15 ml Falcon Tube	VWR	Artikel-Nr.: 470225-000
25 mL serologische	Fisher Scientific	14955235
Ammoniumbicarbonat (ABC)	ThermoFisher Scientific	Nr. A643-500
Aceton	Sigma Aldrich	34850-1L
BSA-Assay-Kit	VWR	CA62408-940
Zentrifuge 5810 R	Sigma Aldrich	EP022628188
Dithiothreitol (DVB-T)	ThermoFisher Scientific	Nr. R0861	Bereiten Sie 1 Mio. Vorrat an DVB-T-Aliquoten vor und lagern Sie sie bei -20 °C
Fötales Rinderserum (FBS)	ThermoFisher Scientific	12483020	Auftauen, Aliquote vorbereiten und bei -20°C lagern
Heizblock
HEPES	Sigma Aldrich	Nr. H3375	8M Urea/40m HEPES aliquots zubereiten, bei -20 °C lagern
Jodacetamid (IAA)	Fisher Scientific	AAA1471514	Bereiten Sie 0,55 Mio. IAA-Aliquots vor und lagern Sie sie bei -20 °C. Vermeiden Sie Lichteinwirkung
L-Glutamin	Fisher Scientific	25030081	Auftauen, Aliquote vorbereiten und bei -20°C lagern
Flüssigstickstoff
LoBind Mikrozentrifugenröhrchen	Eppendorf	Tel.: 13-698-794
Penicillin, Streptomycin, Amphotericin	Sigma Aldrich	Nr. A5955	Auftauen, Aliquote vorbereiten und bei -20°C lagern
Neutrophilen-differenzierte HL60-Zellen
Phosphatgepufferte Lösung (PBS)	Bioladen	PBS408	Bei Raumtemperatur lagern
Sonden-Ultraschallgerät	Fisher Scientific	Tel.: 100-132-894
Proteasehemmer-Cocktail (PIC) Tablette	Sigma Aldrich	5892791001	Bei 4°C lagern
RPMI 1640	ThermoFisher Scientific	11875093	Bei 4°C lagern
Natriumdodecylsulfat (SDS)	ThermoFisher Scientific	Nr. J18220. A1	2%ige SDS-Lösung herstellen
SpeedVac Zentrifuge	Eppendorf	Tel.: 07-748-15
T75 Kolben	ThermoFisher Scientific	156499
Tris HCL pH 8,5	Fisher Scientific	Nr. BP152-1	Bei 4°C lagern
Ultraschallbad	VWR	Artikel-Nr.: 97043-960
Harnstoff	Bioladen	URE001.1