Ein STAGE-Spitzenverfahren zur Entsalzung und Reinigung von Peptiden

Zusammenfassung

Dieses Video demonstriert die Peptidaufreinigung durch das STAGE Tip-Verfahren. Eine Miniatursäule mit Harzkügelchen, die an lange Kohlenwasserstoffketten gebunden sind, erleichtert die Reinigung auf Basis hydrophober Wechselwirkungen. Beim Laden einer vorverdauten Peptidprobe in die Säule binden sich die Peptidfragmente an die Harzkügelchen, wodurch Verunreinigungen passieren können. Ein Elutionspuffer, der die hydrophobe Wechselwirkung stört, wird zur Eluierung der Peptidfragmente angewendet.

Protokoll

>1. Reinigung und Entsalzung von Peptiden

1. Packen Sie drei Schichten C18-Harz in eine 200-μl-Pipettenspitze für jede Peptidprobe, um eine STop And Go Extraction (STAGE)-Spitze zu konstruieren.
2. 1/10 Stopplösung (20 % Acetonitril [ACN)] und 6 % Trifluoressigsäure [TFA]) zu den Proben geben.
3. Zentrifugieren Sie Proben für die Pelletfällung bei 13.200 U/min für 10 min.
4. Den Überstand in ein neues 2-ml-Röhrchen umfüllen und das Pellet entsorgen.
5. Waschen Sie die Spitzen mit 100 μl 100 % ACN.
6. Zentrifugieren Sie die STAGE-Spitzen bei 1000 x g für 2 min.
   Anmerkung: Zentrifugieren Sie die STAGE-Spitzen, bis die gesamte Flüssigkeit durch das C18-Harz gelaufen ist.
7. Waschen Sie die STAGE-Spitzen mit 50 μl Puffer B (80 % ACN, 0,5 % Essigsäure und ddH₂O).
8. STAGE Spitzen bei 1000 x g für 2 min zentrifugieren.
9. Waschen Sie die STAGE-Spitzen mit 200 μl Puffer A (2 % ACN, 0,1 % TFA, 0,5 % Essigsäure und ddH₂O).
10. Die Spitzen des Zentrifugentisches bei 1000 x g für 2 min.
11. Laden Sie Proben in STAGE-Tipps.
12. Zentrifugieren Sie die Proben bei 1000 x g für 3-5 min.
13. STAGE-Spitzen mit 200 μl Puffer A waschen.
14. Zentrifugieren Sie bei 1000 x g für 3-5 min.
15. Geben Sie 50 μl Puffer B in jede STAGE-Spitze
16. Mit einer Spritze eluieren Sie Proben, die Puffer B enthalten, in ein 0,2-ml-PCR-Streifenröhrchen.
17. Sobald die Proben eluiert sind, trocknen Sie die Peptide mit einer Vakuumzentrifuge für 45 Minuten.
18. Sobald die Proben trocken sind, lagern Sie sie bei Raumtemperatur, bis MS.
    Anmerkung: Wenn eine Peptidlagerung von mehr als zwei Wochen erforderlich ist, empfehlen wir eine Lagerung bei -20 °C.
19. Führen Sie die Probe auf einer hochauflösenden Massenspektrometrie (MS) durch.
    Anmerkung: Die Messparameter der Probe (z. B. Menge der geladenen Probe, Länge des Flüssigkeitschromatographie-Gradienten, Auflösung) hängen von den verwendeten Instrumenten ab.

>2. Proteomische Profilerstellung von Neutrophilen

1. Verarbeitung von Rohdaten
   1. Laden Sie Rohdatendateien, die Sie von MS erhalten haben, in MaxQuant hoch.
   2. Die Software ist so konzipiert, dass sie mit datenabhängigen Bottom-up-Erfassungsdateien ausgeführt werden kann, und viele Standardparameter sind für solche Proben optimiert. Zu den Standardparametern gehören der Verdau (Trypsin P), variable Modifikationen der Methioninoxidation (Oxidation (M)) und der N-Acetylierung von Proteinen (Acetyl (Protein N-term)) sowie feste Modifikationen der Carbamidomethylierung von Cystein (Carbamidomethyl (C)).
   3. Zu den Anpassungen dieser Parameter gehören die markierungsfreie Quantifizierung (LFQ; setzen Sie die Mindestanzahl des Verhältnisses auf 1), die Übereinstimmung zwischen den Durchläufen (d. h. ein/aus) und eine Mindestanzahl von Peptiden, die pro Protein identifiziert werden (empfohlene Einstellung auf 2).
   4. Importieren Sie in den globalen Parametern die FASTA-Datei zur Sequenzidentifikation. Für dieses Experiment wurde die FASTA-Datei des Homo sapiens (Mensch) (UP000005640) aus der Uniprot-Datenbank verwendet. Anmerkung: Notieren Sie die folgenden Informationen für die Aufzeichnung: Organismus-ID = 9606; die Anzahl der Proteine = 79.740; Datum des Downloads der Datei.
   5. Legen Sie die Anzahl der Computerkerne fest, die für die Verarbeitung verwendet werden sollen, und wählen Sie Start aus.
   6. Nach Abschluss von MaxQuant wird ein "kombinierter" Ordner zusammen mit anderen Dateien generiert.
      Anmerkung: Die anderen Dateien können zur Identifizierung von Peptiden, Modifikationen usw. verwendet werden und werden möglicherweise benötigt, um den vollständigen Datensatz in Datenrepositories hochzuladen, einschließlich Proteome Xchange (PRIDE).
2. Datenanalyse und -visualisierung in Perseus
   1. Laden Sie die 'proteingroups.txt' in Perseus hoch und wählen Sie alle LFQ-Intensitätsdateien für das 'Haupt'-Fenster aus.
      Anmerkung: Baseline-Informationen werden direkt in die Perseus-Fenster importiert, aber andere Informationen (z. B. Änderungsstellen) müssen möglicherweise manuell hinzugefügt werden.
   2. Filtern Sie Reihen, indem Sie Verunreinigungen, reverse Peptide und Peptide entfernen, die nur nach Standort identifiziert werden.
   3. Transformieren Sie die Daten nach Protokoll₂(x).
   4. Um die Anzahl der Proteine zu beobachten, die in jedem Replikat nachgewiesen werden, erstellen Sie ein numerisches Venn-Diagramm.
   5. Legen Sie kategoriale Anmerkungen für jede Stichprobe fest.
      Anmerkung: Zu statistischen Zwecken sollten alle Replikate einer biologischen Probe denselben Namen haben.
   6. Filtern Sie die Zeilen basierend auf gültigen Werten, wobei das Protein in >50 % der Replikate und innerhalb mindestens einer Gruppe identifiziert wurde.
      Anmerkung: Die Filterung nach gültigen Werten kann je nach Versuchsaufbau und Zielen strenger sein (z. B. muss Protein in allen Proben vorhanden sein).
   7. Um fehlende Werte für LFQ zu ersetzen, kann eine Imputation aus der Normalverteilung durchgeführt werden.
      HINWEIS: Die Standardparameter sind für LFQ-Daten optimiert, können aber wie gewünscht angepasst werden.
   8. Fügen Sie den Proteinzeilen Anmerkungsinformationen hinzu. Fügen Sie die txt.gz FASTA-Datei (von der Perseus-Website bezogen) in die Ordner 'bin', 'conf' und 'annotation' ein und fügen Sie bestimmte Begriffe ein (z. B. Proteinnamen, Gennamen, Genontologie).
   9. Die Matrix ist nun vollständig und kann für statistische Tests (z. B. ANOVA, t-Tests) verwendet werden, um signifikante Veränderungen in der Proteinhäufigkeit zwischen den getesteten Bedingungen zu bestimmen. Andere Formen von Visualisierungswerkzeugen umfassen Diagramme zur Hauptkomponentenanalyse, Heatmaps und Kategorieanreicherung.
      Anmerkung: Annotationsinformationen können auch von UniProt heruntergeladen und in das Perseus-Framework integriert werden.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
15 ml Falcon Tube	VWR	Artikel-Nr.: 470225-000
25 mL serologische	Fisher Scientific	14955235
Ammoniumbicarbonat (ABC)	ThermoFisher Scientific	Nr. A643-500
Essigsäure	Sigma Aldrich	1099510001
Aceton	Sigma Aldrich	34850-1L
Acetonitril (ACN), MS-Qualität	durchbohren	TS-51101
BSA-Assay-Kit	VWR	CA62408-940
C18-Festplatten (STAGE-Tipps)	Fisher Scientific	13110019
Zentrifuge 5810 R	Sigma Aldrich	EP022628188
Dithiothreitol (DVB-T)	ThermoFisher Scientific	Nr. R0861	Bereiten Sie 1 Mio. Vorrat an DVB-T-Aliquoten vor und lagern Sie sie bei -20 °C
Fötales Rinderserum (FBS)	ThermoFisher Scientific	12483020	Auftauen, Aliquote vorbereiten und bei -20°C lagern
HEPES	Sigma Aldrich	Nr. H3375	8M Urea/40m HEPES aliquots zubereiten, bei -20 °C lagern
Hochauflösendes Massenspektrometer	ThermoFisher Scientific	726042
Jodacetamid (IAA)	Fisher Scientific	AAA1471514	Bereiten Sie 0,55 Mio. IAA-Aliquots vor und lagern Sie sie bei -20 °C. Vermeiden Sie Lichteinwirkung
L-Glutamin	Fisher Scientific	25030081	Auftauen, Aliquote vorbereiten und bei -20°C lagern
LoBind Mikrozentrifugenröhrchen	Eppendorf	Tel.: 13-698-794
MaxQuant	https://www.maxquant.org/
PCR-Streifen-Röhrchen	VWR	Tel.: 76318-802
Penicillin, Streptomycin, Amphotericin	Sigma Aldrich	Nr. A5955	Auftauen, Aliquote vorbereiten und bei -20°C lagern
Perseus	https://www.maxquant.org/Perseus/
phosphatgepufferte Lösung (PBS)	Bioladen	PBS408	Bei Raumtemperatur lagern
Sonden-Ultraschallgerät	Fisher Scientific	Tel.: 100-132-894
Proteasehemmer-Cocktail (PIC) Tablette	Sigma Aldrich	5892791001	Bei 4°C lagern
RPMI 1640	ThermoFisher Scientific	11875093	Bei 4°C lagern
Natriumdodecylsulfat (SDS)	ThermoFisher Scientific	Nr. J18220. A1	2%ige SDS-Lösung herstellen
SpeedVac Zentrifuge	Eppendorf	Tel.: 07-748-15
STAGE Kippzentrifuge	Sonation	STC-V2
T75 Kolben	ThermoFisher Scientific	156499
Trifluoressigsäure	ThermoFisher Scientific	Artikel-Nr.: 85183
Tris HCL pH 8,5	Fisher Scientific	Nr. BP152-1	Bei 4°C lagern
Trypsin/LysC	Thermo Fisher Scientific	Nr. A40009	aliquotieren und bei -20°C lagern
Ultraschallbad	VWR	Artikel-Nr.: 97043-960
Harnstoff	Bioladen	URE001.1