Ein STAGE-Spitzenverfahren zur Entsalzung und Reinigung von Peptiden

>1. Reinigung und Entsalzung von Peptiden

1. Packen Sie drei Schichten C18-Harz in eine 200-μl-Pipettenspitze für jede Peptidprobe, um eine STop And Go Extraction (STAGE)-Spitze zu konstruieren.
2. 1/10 Stopplösung (20 % Acetonitril [ACN)] und 6 % Trifluoressigsäure [TFA]) zu den Proben geben.
3. Zentrifugieren Sie Proben für die Pelletfällung bei 13.200 U/min für 10 min.
4. Den Überstand in ein neues 2-ml-Röhrchen umfüllen und das Pellet entsorgen.
5. Waschen Sie die Spitzen mit 100 μl 100 % ACN.
6. Zentrifugieren Sie die STAGE-Spitzen bei 1000 x g für 2 min.
   Anmerkung: Zentrifugieren Sie die STAGE-Spitzen, bis die gesamte Flüssigkeit durch das C18-Harz gelaufen ist.
7. Waschen Sie die STAGE-Spitzen mit 50 μl Puffer B (80 % ACN, 0,5 % Essigsäure und ddH₂O).
8. STAGE Spitzen bei 1000 x g für 2 min zentrifugieren.
9. Waschen Sie die STAGE-Spitzen mit 200 μl Puffer A (2 % ACN, 0,1 % TFA, 0,5 % Essigsäure und ddH₂O).
10. Die Spitzen des Zentrifugentisches bei 1000 x g für 2 min.
11. Laden Sie Proben in STAGE-Tipps.
12. Zentrifugieren Sie die Proben bei 1000 x g für 3-5 min.
13. STAGE-Spitzen mit 200 μl Puffer A waschen.
14. Zentrifugieren Sie bei 1000 x g für 3-5 min.
15. Geben Sie 50 μl Puffer B in jede STAGE-Spitze
16. Mit einer Spritze eluieren Sie Proben, die Puffer B enthalten, in ein 0,2-ml-PCR-Streifenröhrchen.
17. Sobald die Proben eluiert sind, trocknen Sie die Peptide mit einer Vakuumzentrifuge für 45 Minuten.
18. Sobald die Proben trocken sind, lagern Sie sie bei Raumtemperatur, bis MS.
    Anmerkung: Wenn eine Peptidlagerung von mehr als zwei Wochen erforderlich ist, empfehlen wir eine Lagerung bei -20 °C.
19. Führen Sie die Probe auf einer hochauflösenden Massenspektrometrie (MS) durch.
    Anmerkung: Die Messparameter der Probe (z. B. Menge der geladenen Probe, Länge des Flüssigkeitschromatographie-Gradienten, Auflösung) hängen von den verwendeten Instrumenten ab.

>2. Proteomische Profilerstellung von Neutrophilen

1. Verarbeitung von Rohdaten
   1. Laden Sie Rohdatendateien, die Sie von MS erhalten haben, in MaxQuant hoch.
   2. Die Software ist so konzipiert, dass sie mit datenabhängigen Bottom-up-Erfassungsdateien ausgeführt werden kann, und viele Standardparameter sind für solche Proben optimiert. Zu den Standardparametern gehören der Verdau (Trypsin P), variable Modifikationen der Methioninoxidation (Oxidation (M)) und der N-Acetylierung von Proteinen (Acetyl (Protein N-term)) sowie feste Modifikationen der Carbamidomethylierung von Cystein (Carbamidomethyl (C)).
   3. Zu den Anpassungen dieser Parameter gehören die markierungsfreie Quantifizierung (LFQ; setzen Sie die Mindestanzahl des Verhältnisses auf 1), die Übereinstimmung zwischen den Durchläufen (d. h. ein/aus) und eine Mindestanzahl von Peptiden, die pro Protein identifiziert werden (empfohlene Einstellung auf 2).
   4. Importieren Sie in den globalen Parametern die FASTA-Datei zur Sequenzidentifikation. Für dieses Experiment wurde die FASTA-Datei des Homo sapiens (Mensch) (UP000005640) aus der Uniprot-Datenbank verwendet. Anmerkung: Notieren Sie die folgenden Informationen für die Aufzeichnung: Organismus-ID = 9606; die Anzahl der Proteine = 79.740; Datum des Downloads der Datei.
   5. Legen Sie die Anzahl der Computerkerne fest, die für die Verarbeitung verwendet werden sollen, und wählen Sie Start aus.
   6. Nach Abschluss von MaxQuant wird ein "kombinierter" Ordner zusammen mit anderen Dateien generiert.
      Anmerkung: Die anderen Dateien können zur Identifizierung von Peptiden, Modifikationen usw. verwendet werden und werden möglicherweise benötigt, um den vollständigen Datensatz in Datenrepositories hochzuladen, einschließlich Proteome Xchange (PRIDE).
2. Datenanalyse und -visualisierung in Perseus
   1. Laden Sie die 'proteingroups.txt' in Perseus hoch und wählen Sie alle LFQ-Intensitätsdateien für das 'Haupt'-Fenster aus.
      Anmerkung: Baseline-Informationen werden direkt in die Perseus-Fenster importiert, aber andere Informationen (z. B. Änderungsstellen) müssen möglicherweise manuell hinzugefügt werden.
   2. Filtern Sie Reihen, indem Sie Verunreinigungen, reverse Peptide und Peptide entfernen, die nur nach Standort identifiziert werden.
   3. Transformieren Sie die Daten nach Protokoll₂(x).
   4. Um die Anzahl der Proteine zu beobachten, die in jedem Replikat nachgewiesen werden, erstellen Sie ein numerisches Venn-Diagramm.
   5. Legen Sie kategoriale Anmerkungen für jede Stichprobe fest.
      Anmerkung: Zu statistischen Zwecken sollten alle Replikate einer biologischen Probe denselben Namen haben.
   6. Filtern Sie die Zeilen basierend auf gültigen Werten, wobei das Protein in >50 % der Replikate und innerhalb mindestens einer Gruppe identifiziert wurde.
      Anmerkung: Die Filterung nach gültigen Werten kann je nach Versuchsaufbau und Zielen strenger sein (z. B. muss Protein in allen Proben vorhanden sein).
   7. Um fehlende Werte für LFQ zu ersetzen, kann eine Imputation aus der Normalverteilung durchgeführt werden.
      HINWEIS: Die Standardparameter sind für LFQ-Daten optimiert, können aber wie gewünscht angepasst werden.
   8. Fügen Sie den Proteinzeilen Anmerkungsinformationen hinzu. Fügen Sie die txt.gz FASTA-Datei (von der Perseus-Website bezogen) in die Ordner 'bin', 'conf' und 'annotation' ein und fügen Sie bestimmte Begriffe ein (z. B. Proteinnamen, Gennamen, Genontologie).
   9. Die Matrix ist nun vollständig und kann für statistische Tests (z. B. ANOVA, t-Tests) verwendet werden, um signifikante Veränderungen in der Proteinhäufigkeit zwischen den getesteten Bedingungen zu bestimmen. Andere Formen von Visualisierungswerkzeugen umfassen Diagramme zur Hauptkomponentenanalyse, Heatmaps und Kategorieanreicherung.
      Anmerkung: Annotationsinformationen können auch von UniProt heruntergeladen und in das Perseus-Framework integriert werden.