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Alle Verfahren, die die Probenentnahme beinhalten, wurden in Übereinstimmung mit den IRB-Richtlinien des Instituts durchgeführt.
>1. Pseudotyp-basierter Neutralisationsassay
HINWEIS: pMN ist die Hemmung der durch Pseudotyp-Viren (PV) vermittelten Transduktion über humane Rekonvaleszentenserumproben, die Antikörper enthalten, die gegen den SARS-CoV-2-Spike gerichtet sind.
- In einer 96-Well-Weißplatte mit Hilfe einer Mehrkanalpipette 50 μl Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), 10 % fetavales Rinderserum (FBS), 1 % Penicillin/Streptomycin (Pen/Strepto) in die Zeilen B bis H, Spalten 1-12 geben.
- Geben Sie 5 μl Rekonvaleszentenseren in die Vertiefungen der Reihe A, Spalten 2-10, mit einem Gesamtvolumen von 100 μl DMEM/10 % FBS/1 % P/S. Geben Sie eine bekannte Menge (z. B. 5 μl) positiven (NIBSC 20/162 Kalibrant, HICC-Pool 2 oder HICC-Pool 3) und negativen Antiseren (Patientenseren, die vor 2019 entnommen wurden) in die Vertiefungen A11 und A12 als Kontrollen.
- Entnehmen Sie 50 μl aus den Wells der Reihe A und führen Sie zweifache serielle Verdünnungen in allen darunter liegenden Wells durch.
- Verwenden Sie bei jedem Verdünnungsschritt eine Mehrkanalpipette, um 5-10 Mal zu mischen, indem Sie auf und ab pipettieren und darauf achten, dass keine Luftblasen entstehen.
- Nach Abschluss der seriellen Verdünnung sollten die letzten 50 μl aus der letzten Vertiefung jeder Säule verworfen werden.
HINWEIS: Zu diesem Zeitpunkt sollte jede Vertiefung 50 μl gemischtes DMEM und serielle Verdünnungen von Patientenseren oder Kontrollseren enthalten.
- Zentrifugieren Sie die Platte 1 Minute lang bei 500 U/min, um sicherzustellen, dass keine Flüssigkeit an den Wänden des Brunnens zurückbleibt.
- Berechnen Sie anhand von Daten, die durch Pseudotyp-Titration gewonnen wurden, die Menge an DMEM, die erforderlich ist, um Ihr SARS-CoV-2-PV zu verdünnen, um 5 x 106 RLU in 50 μl mit einem Gesamtvolumen von 5 ml zu erhalten.
- Mischen Sie diese verdünnte PV-Lösung in einem Pipettenbecken mit der Mehrkanalpipette und aliquotieren Sie 50 μl in jede Vertiefung auf der Platte, mit Ausnahme der Vertiefungen A6-A12 (nur Küvettenkontrolle). A1-A6 dient als reine PV-Steuerung.
- Zentrifugieren Sie die Platte 1 Minute lang bei 500 U/min, um sicherzustellen, dass keine Viren an den Wänden der Vertiefung zurückbleiben.
- Inkubieren Sie die Platten 1 h lang bei 37 °C 5 % Kohlendioxid (CO2), damit das Serum Zeit hat, das SARS-CoV-2-Glykoprotein zu binden.
- Bereiten Sie eine Platte mit HEK 293T/17-Zielzellen vor, die 24 Stunden zuvor mit Angiotensin-Converting-Enzym 2 (ACE2)-Expressionsplasmid und Transmembran-Serinprotease 2 (TMPRSS2)-Expressionsplasmid-Plasmiden transfiziert wurden.
- Entfernen Sie den Nährboden von der Platte.
- Waschen Sie den Teller zweimal mit 2 ml PBS auf einer Seite der Schüssel, um eine Zellablösung und Entsorgung zu vermeiden.
- Geben Sie 2 ml Trypsin in die Platte und stellen Sie die Platte in den Inkubator, bis sich die Zellen gelöst haben.
- Nachdem sich die Zellen abgelöst haben, geben Sie 6 ml DMEM/10 % FBS/1 % Penicillin/Streptomycin in die Platte, um die Trypsinaktivität zu unterdrücken und die Zellen sanft zu resuspendieren.
- Zählen Sie die Zellen mit dem TC20TM Automated Cell Counter oder dem Zählkammer-Objektträger und geben Sie 1 x 104 Zellen mit einem Gesamtvolumen von 50 μl in jede Vertiefung
.
- Die Platte 48-72 h bei 37 °C und 5 % CO2 inkubieren.
- Lesen Sie die Platte mit dem Bright GloTM Luziferase-Assay-System auf einem GloMax® Navigator Mikrotiterplatten-Luminometer ab, indem Sie das Kulturmedium aus allen Vertiefungen entfernen und 25 μl einer 1:1-Mischung aus PBS: Bright GloTM Luciferase Assay-Reagenz hinzufügen.
- Berechnen Sie aus den vom Luminometer gelieferten Rohdaten die halbmaximale Hemmkonzentration (IC50) neutralisierender Antikörpertiter unter Verwendung etablierter Protokolle. IC50-Werte unter 1:40 Verdünnung gelten als negativ. Die Daten können alternativ mit AutoPlate ausgewertet werden.