Assays zur qualitativen und quantitativen Bestimmung der Glukosekonzentration im Urin von Mäusen

Zusammenfassung

Dieses Video zeigt ein Verfahren zum Sammeln von Mäuseurin und zur Bestimmung seines Glukosespiegels. Um den Glukosespiegel zu bestimmen, tauchen Sie einen mit Enzymen und einem chromogenen Farbstoff beschichteten Teststreifen in die Probe und initiieren Sie eine Farbänderung, die den Glukosespiegel anzeigt. Zur Quantifizierung des Glukosespiegels im Urin wird eine Urinprobe in eine Multiwell-Platte mit eskalierenden Glukosekonzentrationen gegeben, das Reaktionsgemisch hinzugefügt und inkubiert. Messen Sie die Absorption, um eine Standardkurve zu erstellen, und berechnen Sie die Glukosewerte basierend auf der Absorption der Probe.

Protokoll

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

>1. Spot-Urin-Glukosetest

1. Legen Sie ein Stück sauberen Parafilm auf eine ebene Fläche.
2. Nimm eine Maus vorsichtig am Schwanz und setze sie auf den Parafilm.
3. Halten Sie die Maus mit Daumen und Zeigefinger am Genick fest. Heben Sie die Maus vorsichtig auf, während Sie am Genick festgehalten sind, was dazu führt, dass die Maus als Stressreaktion uriniert. Lassen Sie einen Tropfen Urin auf die Oberfläche des Parafilms fallen. Bringen Sie die Maus in ihren Käfig zurück, nachdem Sie den Urintropfen aufgefangen haben.
4. Tauchen Sie das Reagenzende eines Diastix-Streifens in den frischen Urintropfen, der sich auf der Parafilm-Oberfläche angesammelt hat. Entfernen Sie den Streifen sofort und legen Sie ihn flach mit der Farbseite nach oben auf eine Oberfläche. Warten Sie mindestens 30 Sekunden, bis sich eine Farbe auf dem Streifen vollständig entwickelt hat. Vergleichen Sie die entwickelte Farbe mit der Referenzkarte, die auf dem Diastix-Container bereitgestellt wird (Abbildung 1).
   tipps: Wenn die Maus nicht auf den Parafilm uriniert, üben Sie mit dem Zeigefinger sanften Druck auf den Unterbauch der Maus (um die Harnblase herum) aus. Dieser Ansatz hilft, Urintropfen auf den Parafilm abzugeben. Bei Mäusen, die nach dem oben beschriebenen Verfahren nicht urinieren, warten Sie 20 Minuten und beginnen Sie den Vorgang erneut. Stellen Sie sicher, dass alle Verfahren unter Einhaltung der IACUC-Richtlinien durchgeführt werden.

>2. Entnahme von 24-Stunden-Urin mit einem Stoffwechselkäfig der Maus

1. Montieren Sie einen Tecniplast Stoffwechselkäfig (Abbildung 2) gemäß den Anweisungen des Herstellers.
2. Füllen Sie die Zuführgarnitur mit pulverförmigem Futter und befestigen Sie die Zuführgarnitur an der entsprechenden Metalllasche an der oberen Kammer.
3. Befestigen Sie die Wasserflaschenhalterung an der restlichen Metalllasche an der oberen Kammer.
4. Füllen Sie die leere Wasserflasche und schieben Sie sie dann in die Flaschenhalterung, wobei Sie darauf achten, dass sich der Trinkschlauch im Loch befindet.
5. Setzen Sie eine Maus in den Stoffwechselkäfig und decken Sie ihn dann mit einem Deckel ab.
6. Stellen Sie sicher, dass der Käfigdeckel richtig sitzt.
7. Positionieren Sie ein Urinauffangröhrchen und ein Kotauffangröhrchen an den entsprechenden Stellen auf dem Boden der unteren Kammer.
8. Nehmen Sie nach 24 Stunden das Urinsammelröhrchen und führen Sie einen Glukosetest durch, um die Glukosekonzentration im Urin zu bestimmen. Wenn der Glukosetest nicht am selben Tag durchgeführt wird, frieren Sie die Urinprobe im -80 °C heißen Gefrierschrank ein.

>3. Bestimmung der Glukosekonzentration im Urin im 24-Stunden-Urin

1. Wenn die Urinprobe bei -80 °C gelagert wird, lassen Sie die Probe auftauen, bevor Sie einen Glukosetest durchführen.
2. Bereiten Sie aus einem Stamm von 100 mg/dl acht Standards von 25 mg/dl bis 0 mg/dl gemäß den Anweisungen des Assay-Kits vor.
3. Bereiten Sie Standard-Wells und Urinproben-Wells in einer 96-Well-Platte vor, alles in Duplikaten, gemäß dem Kit-Handbuch.
4. Nachdem Sie die Reaktion eingeleitet haben, indem Sie die empfohlene Menge der Enzymmischung in alle Vertiefungen gegeben haben, decken Sie die Platte ab und lassen Sie sie 10 Minuten lang bei 37 °C inkubieren.
5. Lesen Sie die Absorption bei 500-520 nm mit einem Plattenlesegerät.
6. Analysieren Sie die Daten gemäß den Anweisungen des Assay-Kits. Zeichnen Sie die Extinktion jedes Standards im Vergleich zur Glukosekonzentration auf und verwenden Sie das Diagramm, um die Glukosekonzentration der 24-Stunden-Urinprobe zu bestimmen.

Ergebnisse

Abbildung 1. Spot-Urin-Glukosetest. Die auf Parafilm gesammelten Urintropfen der Maus und die Farbreferenzkarte auf dem Diastix-Behälter.

Abbildung 2. Tecniplast Stoffwechselkäfig für die 24-stündige Urinsammlung von Mäusen. In d...