Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. Vorbereitung des MRSA HI Antigen Proteins
- Beziehen Sie Klone des oberflächenbestimmenden Faktors B (IsdB) und der α-Hämolysin-Mutante (Hla) aus kommerziellen Quellen (siehe Materialtabelle), führen Sie eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR)-Amplifikation durch, um IsdB- und Hla-Gene zu amplifizieren, und ligieren Sie ihre Produkte an das PGEX-6P-2-Plasmid (kommerziell erhältlich; siehe Materialtabelle). Bildschirm mit dem Vektor Xl/blauer Stamm von Escherichia coli.
- Transformieren Sie den positiven Klon in E. coli BL21-kompetente Zellen (siehe Materialtabelle) und amplifizieren Sie ihn mit Haikultur.
- Exprimieren Sie das Antigen und isolieren Sie es nach der Induktion mit Isopropyl-β-D-1-mercaptogalactopyranosid und Isolatkits für multimodale Chromatographie (MMC) (siehe Materialtabelle).
- Charakterisieren Sie das Antigenprotein und reinigen Sie es mit einem vollautomatischen Reiniger.
- Affinitätsreinigung von Gutathion-S-Transferase (GST)-markierten Proteinen aus geklärten Lysaten mit einem kommerziell erhältlichen Affinitätschromatographieharz (siehe Materialtabelle).
- Aufreinigung der rekombinanten Proteine durch Isopropyl-β-D-1-Mercaptogalactopyranosid und multimodale Chromatographie (MMC).
- Entfernen Sie das Endotoxin mit der Triton X-114 Phasentrennmethode. Kurz 1 % Triton X-114 mit rekombinantem Proteineluat bei 0 °C für 5 min mischen, um eine homogene Lösung zu gewährleisten, und 5 min bei 37 °C inkubieren, damit sich zwei Phasen bilden können.
- Verwenden Sie die bakterielle Endotoxin-Testmethode mit Turtle-Kits (siehe Materialtabelle), um die Endotoxinkonzentration nachzuweisen. Der Endotoxingehalt für Proteinantigen liegt bei 0,06 EU/μg und damit unter dem internationalen Standard (1,5 EU/μg).
- Führen Sie einen Interferenztest durch, um den möglichen Einfluss des Testprodukts auf den Endotoxinnachweis auszuschließen.
Anmerkung: Gemäß dem Anhang 2020 des chinesischen Arzneibuchs sollte der Endotoxingehalt weniger als 5 EU/Dosis betragen. Die Empfindlichkeit von Limulus-Lysat (λ0,25 EU/ml) und das maximale effektive Verdünnungsverhältnis von 33,3 wurden auf der Grundlage der maximal gültigen Verdünnung berechnet, MVD = cL/λ, wobei L der Grenzwert für bakterielles Endotoxin für den Prüfling ist, c die Konzentration der Lösung des Prüflings ist und wenn L in EU/m ausgedrückt wird, c ist gleich 1,0 mg/ml. λ ist die markierte Sensitivität (EU/ml) des Pfeilschwanzkrebs-Reagenzes in der Gelmethode.
- Rekombination des Antigens (48 kDa, bestimmt durch 12 % Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese [SDS-PAGE]) bei 1,5 mg/ml in sterilem Wasser ohne Endotoxin oder phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) (Natriumdichlorat-Methode).
HINWEIS: Die Spitzenzeit des Proteins betrug 13,843 min, die Reinheit betrug 99,4 % (Hochleistungsflüssigkeitschromatographie-Methode) und das Protein wurde bei -70 °C gelagert. Als PCR-Template wurde genomische DNA verwendet, die aus dem S. aureus-Stamm MRSA252 extrahiert wurde (siehe Materialtabelle). Das IsdB-Gen wurde mit dem Forward-Primer 59-CGCGGATCCATGAATGGCGAAGCAAAAGCAG
C-39 und die Rückseitenzündhütchen 59-TTTTCCTTTTGCGG
CCGCCTATGTCATATCTTTATTAGATTTC-39.
Das Hla-Gen wurde mit dem Forward-Primer PHLAF (GCGGATCCGATTCTGATATTATATATTAAAACC) und dem Reverse-Primer PHLAR (TAAGCGGCCGCTTATCAATTTGTCATTTCTTC) amplifiziert.
>2. Vorbereitung des Nanoemulsionsimpfstoffs
- Gemäß dem Massenverhältnis von 1:6:3 (w/w) werden drei Arten von Hilfsstoffen nacheinander (Isopropylmyristat, Polyoxyethylen-Rizinusöl und Propylenglykol; siehe Materialtabelle) zur HI-Antigen-Proteinlösung (10 mg/ml) gegeben und gut umgerührt. Fügen Sie dann nach und nach sterilisiertes reines Wasser hinzu, um ein Endvolumen von 10 mL zu erreichen, und rühren Sie bei 500 U/min und 25 °C für ca. 20 min.
Anmerkung: Die in diesem Protokoll hergestellte Nanoemulsion hat ein Volumen von 10 ml, und die Massen der drei Hilfsstoffe betragen 0,34 g, 2 g bzw. 1 g. Die Proteinlösung ist hier die Arbeitslösung, die 10-fache Konzentration der.
- Bereiten Sie den Adjuvans-Impfstoff mit Nanoemulsion (1 mg/ml Protein) durch niederenergetische Emulgierungsmethoden vor, um eine klare und transparente flüssige Lösung zu erhalten.
Anmerkung: Die blanke Nanoemulsion (BNE) wurde mit ähnlichen Methoden hergestellt, nur dass Wasser durch HI ersetzt wurde. Bei der üblichen Emulgierungsmethode werden die äußere und innere Phase für die Emulgierung auf ca. 80 °C erhitzt und anschließend nach und nach gerührt und abgekühlt. Bei diesem Prozess wird eine große Menge an Energie verbraucht und schließlich die Emulsion erhalten.
>3. Physikalische Charakterisierung und Stabilität des adjuvanten Nanoemulsionsimpfstoffs
- Charakterisierung der Partikelgröße, des Zetapotenzials und des Polymerdispersionsindex (PDI).
- Bereiten Sie 100 μl des adjuvanten Nanoemulsionsimpfstoffs vor und verdünnen Sie ihn zu Injektionszwecken 50-fach mit Wasser. Fügen Sie 2 ml Probe für den Nachweis hinzu.
- Beobachten Sie die Partikelgröße, das Zetapotenzial und den PDI bei 25 °C mit einem Nano-Zetasizer (ZS; siehe Materialtabelle).
- Transmissionselektronenmikroskopie (TEM)
- 10 μl Nanoemulsionsimpfstoff 50-fach mit Wasser verdünnen, auf ein kohlenstoffbeschichtetes 100-Mesh-Kupfergitter legen und 5 min bei Raumtemperatur mit 1 %iger Phosphowolframsäure (siehe Materialtabelle) färben.
- Überschüssige Phosphowolframsäurelösung mit Filterpapier entfernen.
- Beobachten Sie die Morphologie unter einem Transmissionselektronenmikroskop (siehe Materialtabelle). Untersuchen Sie, ob die fertigen Produkte im Sichtfeld des Elektronenmikroskops nahezu stabil und kreisförmig sind und ob sie eine gute Dispersion aufweisen.
- Rasterelektronenmikroskopie (REM)
- 10 μl des Nanoemulsions-Adjuvans-Impfstoffs 50-fach mit Wasser verdünnen, 10 μl vorverdünnte Proben auf einen Siliziumwafer geben und für 24 Stunden in einen thermostatgesteuerten 37 °C-Inkubator stellen.
- Sprühen Sie das vorbereitete Platin 40 s lang auf das Silikon und kühlen Sie es auf Raumtemperatur ab.
- Beobachten Sie die morphologischen Eigenschaften der präparierten Proben unter einem hochauflösenden Rasterelektronenmikroskop (siehe Materialtabelle). Bestimmen Sie, ob die Proben unter dem Elektronenmikroskop nahezu stabil, kugelförmig und gut im Sichtfeld verteilt sind.
- Morphologische Stabilität
- Geben Sie 1 ml Nanoemulsions-Impfstoffproben in Mikrozentrifugenröhrchen und bewerten Sie die Stabilität frischer Proben, indem Sie 30 Minuten lang bei 13.000 x g bei Raumtemperatur (25 °C) zentrifugieren.
- Beobachten Sie das Aussehen dieser frischen Proben und führen Sie dann einen thermodynamischen Stabilitätstest von sechs Temperaturzyklen durch (ein Zyklus: 48 h lang bei 4 °C, 48 h lang bei 25 °C und 48 h lang 37 °C lagern).
- Lassen Sie die Proben nach der Zentrifugation 15 Minuten lang stehen, um festzustellen, ob ein Tyndall-Effekt vorliegt (ob die Probe unter Licht klar und transparent ist) und ob eine Demulgierung stattgefunden hat (erkennbar an einer klaren Schichtung nach der Demulgierung).
- SDS-PAGE und Western Blot
- Die Proben werden geschüttelt, eine Lösung aus 0,6 ml absolutem Ethanol und 0,3 ml Impfstoff gemischt und zentrifugiert (13.000 x g, 30 min bei Raumtemperatur, 25 °C).
- Den Überstand der Lösung in ein sauberes Röhrchen geben und den Niederschlag mit 0,3 ml Wasser auflösen. Die Überstands- und Fällungslösungen (sowohl leere Nanoemulsion als auch Impfstoff) werden nach der Behandlung mit absolutem Ethanol und destillierter Wasserlösung erhalten und die gleiche 50-fache Verdünnung durchgeführt.
- Mischen Sie 2,5 ml Trenngel A und 2,5 ml Trenngel B (siehe Materialtabelle), fügen Sie 50 μl 10 % Ammoniumpersulfat hinzu und geben Sie die Lösung mit einer Pipette schnell in die Glasplatte. Mischen Sie 1 ml konzentriertes Gel A und 1 ml konzentriertes Gel B, geben Sie 20 μl 10% Ammoniumpersulfat in die Glasplatte, führen Sie einen Kamm in geeigneter Größe ein und warten Sie, bis sich verfestigt hat.
Die in - Schritt 3.5.2 erhaltene verdünnte Probe wird mit insgesamt 5 μl 5x Protein-Loading-Pufferlösung versorgt und 5 Minuten lang zum Kochen gebracht.
- Geben Sie 10 μl erhitztes Protein in die entsprechende Vertiefung und fügen Sie 5 μl Proteinmarker in die Markervertiefung hinzu.
- Schließen Sie die Elektrode an, schalten Sie das Elektrophoresemessgerät ein (siehe Materialtabelle) und stellen Sie die Spannung auf 300 V ein. Schalten Sie das Gerät aus, wenn die Elektrophorese 1 cm von der Unterseite des PAGE-Gummis entfernt ist.
- Entfernen Sie das Gel und spülen Sie es mit doppelt destilliertem Wasser (ddH2O) ab. Coomassie hellblau G-250 Färbelösung (siehe Materialtabelle) für 10 min zugeben. Gießen Sie die Färbelösung aus und spülen Sie das Gel zweimal mit der Lösung und der handelsüblichen Entfärbungslösung ab und erhitzen Sie das Gel 1 Minute lang in der Mikrowelle. Schütteln Sie das Gel 10 Minuten lang und wechseln Sie die Entfärbungslösung wiederholt, bis der Gelhintergrund klar ist. Führen Sie dann eine Gelbildgebung durch (siehe Materialtabelle).
Anmerkung: Der Western Blot wurde vorverarbeitet, wie in den Schritten 3.5.1 bis 3.5.6 beschrieben.
- Tränken Sie drei Filterpapierblöcke mit einem Elektrophorese-Transferpuffer. Die Membran aus Polyvinylidenfluorid (PVDF) wird 30 s lang in Methanol eingeweicht und mit einem halbtrockenen Geltransferinstrument (zwei Schichten Filterpapier, PVDF-Membran, Elektrophoresegel und eine Schicht Filterpapier) übertragen. Verwenden Sie eine Spannung von 23 V, um die Membran für 23 min zu übertragen.
- Entfernen Sie die PVDF-Membran und waschen Sie sie nach dem Transfer einmal mit Tris-gepufferter Kochsalzlösung-Tween 20 (TBST).
- Legen Sie die PVDF-Membran in eine Dichtungslösung (5%ige Magermilchpulverlösung) und versiegeln Sie sie über Nacht bei 4 °C.
- Entfernen Sie die PVDF-Membran und waschen Sie sie dreimal mit TBST oder jeweils 10 min.
- Inkubieren Sie mit dem primären Antikörper (von immunisierten Mäusen mit positivem Serum). Verdünnen Sie den zu testenden Primärantikörper (siehe Materialtabelle) 500-fach (100-fach) mit TBST. Die blockierte PVDF-Membran in den Primärantikörper einsetzen und 1 h bei 37 °C inkubieren.
- Entfernen Sie die PVDF-Membran und waschen Sie sie dreimal mit TBST für jeweils 10 Minuten.
- Inkubieren Sie mit dem Sekundärantikörper (siehe Materialtabelle). Verdünnter Ziegen-Anti-Maus-Sekundärantikörper mit alkalischer Phosphatase (AP)-markierter 5.000-fach mit TBST. Die PVDF-Membran in den Sekundärantikörper einsetzen und 40 min bei 37 °C inkubieren.
- Entfernen Sie die PVDF-Membran und waschen Sie sie viermal mit TBST für jeweils 10 Minuten.
- Tauchen Sie die PVDF-Membranen zum Färben in eine Mischung (gerade genug, um die Membran einzuweichen) aus dem AP-Substrat Nitroblautetrazol (NBT) und BCIP (5-Brom-4-chlor-3'-indolyphosphat, p-Toluidinsalz) (siehe Materialtabelle). Ein positives Ergebnis ist purple.
HINWEIS: Die Ergebnisse müssen eine klare violette Bande sein, und der Probenstreifen und das Molekulargewicht des Antigens sollten sich an der gleichen markierten Position befinden.
>4. Bewertung der Antikörper-Immunantwort auf diesen Impfstoff nach intramuskulärer Verabreichung
HINWEIS: Die Mäuse wurden nach einem veröffentlichten Bericht durch intramuskuläre Injektion des Nanoemulsionsimpfstoffs immunisiert. Den Mäusen wurde PBS als Negativkontrolle verabreicht. 1 Woche nach Abschluss von drei Impfungen wurde den Mäusen Serum entnommen. Die Serumspiegel von IgG und den Unterklassen von IgG1, IgG2a und IgG2b wurden quantitativ mittels Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) bestimmt.
- Antigen-Beschichtung: HI-Protein-Antigen auf 10 μg/ml mit Beschichtungslösung verdünnen und mit 100 μl/Vertiefung in die ELISA-Platte geben. Über Nacht bei 4 °C inkubieren.
Anmerkung: Die Beschichtungslösung wird hergestellt, indem 1,6 g wasserfreies Natriumcarbonat und 2,9 g Natriumbicarbonat in 1 l entionisiertem Wasser gelöst werden.
- Versiegelung: Waschen Sie die Platte (drei Zyklen, jeder Zyklus 300 μL). Geben Sie 300 μl der Dichtungslösung in jede Vertiefung und verschließen Sie die Vertiefungen für 2 Stunden bei 37 °C.
Anmerkung: Die Versiegelungslösung wird durch Zugabe von Tween-20 und Rinderserumalbumin (BSA) zu PBS hergestellt. Der Gehalt an BSA in der PBST-Lösung beträgt 1%.
- Serumverdünnung: Verdünnen Sie das Probenserum von Mäusen 100-mal mit PBST (nehmen Sie 3 μl Serum und fügen Sie es zu 297 μl PBST hinzu und wirbeln Sie es auf) und verwenden Sie 100 μl für jede Serumprobe. Verdünnen Sie das positive Serum und das negative Kontrollserum 100-mal mit PBST, indem Sie 4 μl bis 396 μl PBST hinzufügen und dann durch Vortexen mischen.
- Verdünnung mit doppeltem Verhältnis: Geben Sie 200 μl des oben genannten verdünnten experimentellen Serums in die erste Reihe der beschichteten ELISA-Platte und fügen Sie 100 μl PBST in alle Vertiefungen außer der ersten und 12. Reihe hinzu. Führen Sie eine 1:2-Verdünnung nacheinander von der ersten Reihe aus durch: Stellen Sie die Pipette auf 100 μl ein, übertragen Sie 100 μl von der ersten Reihe in die zweite Reihe und mischen Sie sie 10 Mal mit der Pipette.
- Verdünnen Sie das Serum in Reihe 11 in mehreren Verhältnissen und verwerfen Sie 100 μl Flüssigkeit.
- Verdünntes negatives und positives Serum in die entsprechenden Vertiefungen in Reihe 12 entsprechend der Probenvorlage (siehe Tabelle 1)-100 μl/Vertiefung geben.
- Verschließen Sie die ELISA-Platten mit Frischhaltefolie und inkubieren Sie sie 1 h lang bei 37 °C.
- Verdünnen Sie den Sekundärantikörper Anti-Maus-IgG-HRP (siehe Materialtabelle) mit PBST im Verhältnis 1:10.000.
- Waschen Sie die Platte (drei Zyklen, jeder Zyklus 300 μL). Geben Sie dann 100 μl des verdünnten Sekundärantikörpers in jede Vertiefung und inkubieren Sie die Platte 40 Minuten lang bei 37 °C.
- Färben und Beenden: Waschen Sie die Platte (fünf Zyklen, jeder Zyklus 300 μL). 3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidin (TMB)-Färbelösung (100 μl; siehe Materialtabelle) in jede Vertiefung geben. Die Platten werden 10 Minuten lang bei 37 °C lichtgeschützt aufgestellt und die Reaktion sofort mit 50 μl 2 M H2SO4 beendet.
- Erkennen Sie den Wert der optischen Dichte (OD450) durch einen Enzymmarker (lesen Sie den OD450-Wert innerhalb von 15 min nach Beendigung ab).
Tabelle 1: ELISA-Spike-Sequenz und Verdünnungsvorlage.
