>1. Beurteilung der Spaltung oder des Abbaus von Proteinen in Influenza-A-Virus, IAV-infizierten Zellen durch Caspasen
- 3 x 10,5 Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) oder A549 Zellen pro Well in einer 12-Well-Zellkulturplatte ausstechen.
Anmerkung: Wenn Sie MDCK-Zellen verwenden, stellen Sie sicher, dass der Antikörper gegen das interessierende Protein seine Hundespezies erkennt.
- Säen Sie die Vertiefungen paarweise, d. h. ein Kontrollpaar – eine Vertiefung für die nicht infizierte Scheinprobe und eine für die infizierte Scheinprobe, ein Testpaar – eine Vertiefung für die Probe des nicht infizierten Inhibitors A und eine für die Probe des infizierten Inhibitors A. Erhöhen Sie die Anzahl der Paare mit jedem zusätzlichen Inhibitor.
- Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C unter einer 5%igen CO2 -Atmosphäre über Nacht.
- Infizieren Sie die Zellen am nächsten Tag mit IAV (einem H1N1-Subtyp oder einem anderen Subtyp).
- Bereiten Sie dazu das Virusinokulum vor, indem Sie die Virusbrühe in 400 μl serumfreiem Minimum essentiellem Medium (MEM) (siehe Materialtabelle) bei einer Infektionsmultiplizität (MOI) von 0,5-3,0 plaquebildenden Einheiten (PFU)/Zelle verdünnen (ein Faktor der Verdopplung der Zellzahl bei der Berechnung des MOI).
Anmerkung: Um MDCK-Zellen zu infizieren, ergänzen Sie das Virusinokulum mit Tosylphenylalanylchlormethylketon (TPCK)-trypsin in einer Endkonzentration von 1 μg/ml.
- Entfernen Sie das alte Kulturmedium von den Zellen (Schritt 1.3) und waschen Sie die Zellen mit 1 mL/Vertiefung serumfreiem MEM 2x.
- Geben Sie 400 μl Virusinokulum (Schritt 1.4.1) in die Zellen und inkubieren Sie sie 1 h lang bei 35 °C unter einer Atmosphäre von 5 % Kohlendioxid (CO 2).
- In der Zwischenzeit verdünnen Sie einen Caspase-Inhibitor (z. B. Z-DEVD-FMK), einen Lysosomen-Inhibitor (z. B. Ammoniumchlorid, NH4Cl) oder einen Proteasom-Inhibitor (z. B. MG132) (siehe Materialtabelle) in einer Endkonzentration von 40 μM, 20 mM bzw. 10 μM in serumfreiem MEM (siehe Materialtabelle). Die beiden letztgenannten Hemmstoffe dienen als Kontrolle. Verdünnen Sie ein gleiches Volumen des Lösungsmittels (falls es sich nicht um Wasser handelt), das zur Rekonstitution eines der Inhibitoren verwendet wurde, in einem serumfreien Medium als Mock.
- Entfernen Sie das Virus-Inokulum und waschen Sie die Zellen wie in Schritt 1.5 (1x).
- Geben Sie das serumfreie MEM, 1 ml/Well, Mock oder ergänzt mit einem Inhibitor, zu den Zellen und inkubieren Sie die Zellen wie in Schritt 1.6. Dieser Zeitpunkt wird als 0-h-Infektion angesehen.
- Nach 24 Stunden ernten Sie die Zellen, indem Sie sie mit einem 1-ml-Spritzenkolben (Gummiseite) abkratzen und in ein 1,5-ml-Polypropylen-Röhrchen überführen.
- Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 12.000 x g für 1-2 min bei Raumtemperatur. Entnehmen Sie den Überstand mit einer Pipette.
Anmerkung: Dieser Überstand könnte verworfen oder für einen Plaque-Assay verwendet werden, um den Titer der freigesetzten Virusnachkommen zu messen.
- Waschen Sie das Zellpellet mit 250 μl phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) durch erneute Zentrifugation wie in Schritt 1.11.
- Entfernen Sie den Überstand und lysieren Sie die Zellen durch Zugabe von 80-100 μl Zelllysepuffer (50 mM Tris (Hydroxymethyl) aminomethan (THAM) hydrochlorid (Tris-HCl), pH 7,4, 150 mM Natriumchlorid (NaCl), 0,5 % Natriumdodecylsulfat (SDS), 0,5 % Natriumdesoxycholat, 1 % Triton X-100 und 1x Proteasehemmer-Cocktail, siehe Materialtabelle) und Vortexing.
- Erhitzen Sie das Röhrchen 10 Minuten lang auf 98 °C, um das Gesamtzelllysat vollständig zu lysieren und vorzubereiten. Lagern Sie die Lysate bei 4 °C, um die Schritte 1.15-1.17 am nächsten Tag durchzuführen, aber um optimale Ergebnisse zu erzielen, beenden Sie diese Schritte am selben Tag.
- Schätzen Sie die Proteinmenge in jeder Probe mit einem Bicinchoninsäure (BCA)-Tischassay-Kit (siehe Materialtabelle).
- Lösen Sie gleiche Mengen an Protein aus nicht infizierten und infizierten Proben durch Standard-SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) zusammen mit Molekulargewichtsmarkern auf.
- Das Protein wird auf eine Membran aus Nitrocellulose oder Polyvinylidendifluorid (PVDF) übertragen (siehe Materialtabelle).
Anmerkung: Die PVDF-Membran kann in einigen Western-Blot-Imagern einen hohen Hintergrund liefern; Überprüfen Sie die Kompatibilität.
- Führen Sie Western Blotting durch, um das interessierende Protein mit der an anderer Stelle beschriebenen Methode zu identifizieren.
- Vergleichen Sie die Proteingehalte in den mit Pseudo- und Inhibitoren behandelten infizierten Probenlanzen.
Anmerkung: Wenn sich der Proteinspiegel in der mit Caspase-Inhibitoren behandelten infizierten Probenbahn erholt hat, wird das Protein durch Caspasen gespalten oder abgebaut. Andernfalls wird es entweder durch Lysosom oder Proteasom abgebaut.
- Quantifizieren Sie die Proteinrückgewinnung, indem Sie die Bandenintensität in jeder Spur von mindestens drei Replikaten desselben Experiments messen und mit der entsprechenden Belastungskontrollbande normalisieren.
- Verwenden Sie ein beliebiges modernes Imagegerät und die zugehörige Software (siehe Materialtabelle), um die Western Blots abzubilden und die Proteinrückgewinnung zu quantifizieren.