>1. Bewertung der antimikrobiellen Aktivität
HINWEIS: Alle Arbeiten mit Bakterien sollten unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden, um eine Kontamination des Assays oder des Labors zu vermeiden. Alle Medien sollten vor der Verwendung autoklaviert werden, und Kunststoffartikel und -geräte wie Pipetten müssen steril gehalten werden. Es wird empfohlen, in einer Bioabdichtungshaube (Typ 2) zu arbeiten.
- Glycerinbestände von Bakterienstämmen, die für das Antibiotikagerüst geeignet sind, auf Lysogenie-Bouillon-Agar (LB, hergestellt nach Herstellerangabe) streichen und über Nacht bei 37 °C züchten.
Anmerkung: Die Auswahl der Bakterien zur Prüfung der antibakteriellen Aktivität muss auf der Grundlage des verwendeten Antibiotika-Gerüsts getroffen werden. Ein repräsentativer Bereich von 5-10 Bakterien sollte aus den Spezies ausgewählt werden, von denen bekannt ist, dass sie anfällig für das Antibiotikum sind, unter Berücksichtigung der logistischen Fähigkeiten des Labors. Wenn möglich, sollten auch resistente Bakterien getestet werden. Das unten angegebene Protokoll funktioniert bei den meisten Bakterien, aber prüfen Sie, ob besondere Bedingungen erforderlich sind (z. B. CO2, spezielle Medien) und nehmen Sie bei Bedarf Änderungen vor. Zu den Bakterien, die unter diesen Bedingungen erfolgreich getestet wurden, gehören Staphylokokken, Streptokokken, Bazillen, E. coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa und Enterococcus faecium.
- Nehmen Sie eine einzelne Kolonie von der Platte und kultivieren Sie sie über Nacht in 5 ml kationenangepasster Mueller-Hinton-Bouillon (CAMHB, hergestellt gemäß den Anweisungen des Herstellers) bei 37 °C.
- Verdünnen Sie die Übernachtkulturen ~40-fach in CAMHB und wachsen Sie zu einer mittleren logarithmischen Phase, optische Dichte bei 600 nm (OD600) = 0,4–0,8, Volumen 5 mL).
- Bereiten Sie Stammlösungen jedes fluoreszierenden Antibiotikums mit 1,28 mg/ml in sterilem Wasser vor und pipettieren Sie 10 μl Antibiotikum in die erste Säule einer 96-Well-Platte.
- Geben Sie 90 μl CAMHB in die erste Säule und 50 μl in alle anderen Vertiefungen. Führen Sie dann eine serielle 2-fache Verdünnung über die Platte durch.
- Mischen Sie die Kulturen in der mid-log-Phase gründlich, verdünnen Sie sie auf ~106 koloniebildende Einheiten (KBE)/ml und geben Sie 50 μl in alle Vertiefungen, um eine Endkonzentration von ~5 x 105 KBE/ml zu erreichen< br />
Kulturvolumen (mL) = (Medienvolumen in mL)/(OD600 x 1.000)
Für eine OD600 = 0,5 Kultur in einem gewünschten Medienvolumen von 12 mL addieren Sie z. B. (12/(0,5 x 1.000) = 0,024 mL Kultur zu 12 mL Medium
- Die Platten mit Deckeln abdecken und bei 37 °C 18–24 h ohne Schütteln inkubieren.
- Führen Sie eine visuelle Inspektion der Platten durch, wobei das MHK die Vertiefung mit der niedrigsten Konzentration und ohne sichtbares Wachstum ist.
Anmerkung: In Tabelle 1 finden Sie einige Beispiele für aktive und inaktive fluoreszierende Antibiotika .
2. Analyse der Sondenakkumulation durch Spektrophotometrie
HINWEIS: Diese Zentrifugationszeiten wurden für E. coli optimiert, daher können für andere Spezies geringfügige Änderungen erforderlich sein. Repräsentative Daten zur Sondenakkumulation werden für die NBD-markierte Ciprofloxacin-Sonde berichtet.
- Streifen Sie die Glycerinbestände der Bakterienstämme auf LB-Agar und wachsen über Nacht bei 37 °C.
- Eine einzelne Kolonie vom Teller nehmen und über Nacht in LB bei 37 °C kultivieren.
- Verdünnen Sie die Übernachtkulturen ~50-fach im Medium und wachsen Sie bis zur mittleren logarithmischen Phase (OD600 = 0,4–0,8).
- Zentrifugieren Sie die Kulturen bei 1.470 x g für 25 min und dekantieren Sie das Medium.
- Resuspendieren Sie die Bakterien in 1 mL phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und zentrifugieren Sie sie dann 15 Minuten lang bei 1.470 x g.
- Dekantieren Sie das Medium und resuspendieren Sie die gewaschenen Pellets in PBS auf einen End-ODvon 600 = 2.
- Falls gewünscht, 10,1 μl Carbonylcyanid 3-chlorphenylhydrazon (CCCP, 10 mM in PBS) zu 1 ml Bakterien (Endkonzentration 100 μM) geben und bei 37 °C 10 min inkubieren< />
Anmerkung: CCCP ist ein Effluxpumpenhemmer. Durch die Hinzufügung von CCCP können die Auswirkungen des Ausflusses untersucht werden.
- Die Kulturen bei 18.000 x g für 4 min bei 20 °C zentrifugieren und das Medium dekantieren.
- Geben Sie 1 ml fluoreszierende Antibiotikalösung (10–100 μM in PBS) in das Pellet und inkubieren Sie es 30 Minuten lang bei 37 °C.
- Die Kulturen bei 18.000 x g für 7 min bei 4 °C zentrifugieren und das Medium dekantieren.
- Resuspendieren Sie die Bakterien in 1 ml kaltem PBS und wiederholen Sie Schritt 2.9.
- Schritt 2.10 insgesamt 4x wiederholen.
- Falls gewünscht, lysieren Sie die Bakterien, indem Sie 180 μl Lysepuffer (20 mM Tris-HCl, pH 8,0 und 2 mM Natrium EDTA) und dann 70 μl Lysozym (72 mg/ml in H2O) hinzufügen.
- 30 min bei 37 °C inkubieren, dann 3x einfrieren-auftauen (-78 °C für 5 min, dann 34 °C für 15 min).
- Die Proben werden 20 Minuten lang beschallt und dann 30 Minuten lang auf 65 °C erhitzt.
- Zentrifugieren Sie die lysierten Proben (18.000 x g, 8 min) und filtrieren Sie dann durch eine 10 kDa-Filtermembran.
- Waschen Sie den Filter 4x mit 100 μL Wasser.
- Das Lysat wird auf eine schwarze 96-Well-Platte mit flachem Boden übertragen und die Fluoreszenzintensität auf einem Plattenreader mit Anregungs- und Emissionswellenlängen gemessen, die für das Fluorophor geeignet sind (d. h. 7-(dimethylamino)-2-oxo-2H-chromen-4-yl [DMACA]: λex = 400 nm, λem = 490 nm; Nitrobenzoxadiazol [NBD]: λex = 475 nm, λem = 545 nm).
Anmerkung: In Abbildung 1 finden Sie Beispiele für spektrophotometrische Analysen von Bakterien mit dem fluoreszierenden NBD-markierten Antibiotikum Ciprofloxacin.
