Isolierung invarianter natürlicher Killer-T-Zellen aus einem Mausmodell

Zusammenfassung

Quelle: Meng, M., et al. Adoptive Immuntherapie von iNKT-Zellen bei Glucose-6-Phosphat-Isomerase (G6PI)-induzierten RA-Mäusen.J. Vis. Exp.(2020)

Dieses Video zeigt eine Methode zur Isolierung von invarianten natürlichen Killer-T-Zellen, auch bekannt als iNKT-Zellen. Das Verfahren beginnt mit der Injektion eines synthetischen Glykolipids in eine Maus, um die Aktivierung und Proliferation von iNKT-Zellen in der Milz zu stimulieren. Anschließend werden einzellige Suspensionen aus der Milz hergestellt und mit iNKT-Zell-erkennenden Komplexen, die mit Fluorophoren markiert sind, inkubiert, gefolgt von einer magnetischen Bead-basierten Trennung, um die iNKT-Zellen zu isolieren.

Protokoll

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

>1. Gewinnung von invarianten natürlichen Killer-T-Zellen (iNKT-Zellen) mit adoptiver Zelltherapie

1. Gerichtete Induktion von iNKT-Zellen
   1. Injizieren Sie normalen Mäusen intraperitoneal α-Galactosylceramid (α-GalCer) (0,1 mg/kg Körpergewicht).
2. Isolierung von iNKT-Zellen
   1. Drei Tage nach der Modellierung injizieren Sie Mäusen intraperitoneal 1 % Natrium-Pentobarbital (50 mg/kg Körpergewicht) zur Anästhesie. Ausreichend anästhesierte Mäuse zeigen keine Rückzugsreaktion der Hinterpfoten auf ein Zehenkneifen.
   2. Isolieren Sie die Milz einer DBA/1-Maus nach intraperitonealer Injektion mit α-GalCer. Bereiten Sie eine einzellige Suspension vor, indem Sie die Milz in einem 200-Maschen-Sieb schneiden und zerkleinern.
   3. Die Zellsuspension mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) waschen, 5 min bei 200 x g zentrifugieren und den Überstand verwerfen. Wiederholen.
   4. Resuspendieren Sie die Zellen mit 1 ml Vollblut und Gewebeverdünnungslösung. Fügen Sie 3 ml Maus-Lymphozyten-Trennmedium hinzu und zentrifugieren Sie die Zellen 20 Minuten lang bei 300 x g bei Raumtemperatur.
   5. Sammeln Sie die Schicht aus milchig-weißen Lymphozyten (d.h. die zweite Schicht von oben), waschen Sie sie 2x mit PBS und zählen Sie mit einem automatischen Zellzähler.
3. Positive Selektionsstrategie der magnetisch aktivierten Zellsortierung (MACS) für die Aufreinigung von iNKT-Zellen
   Anmerkung: Für die Vorbehandlung von CD1d-Tetrameren wurde 1 mg/ml α-Galcer auf 200 μg/ml mit 0,5 % Tween-20 und 0,9 % NaCl verdünnt, und 5 μl der resultierenden Lösung wurden zu 100 μl der CD1d-Tetramerlösung hinzugefügt. Die Mischung wurde 12 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert und zur Verwendung bei 4 °C gelagert. T-Zell-Rezeptor (TCR) β wurde 80x mit deionisiertem Wasser verdünnt. Alle anderen Antikörper wurden als Stammlösung verwendet.
   1. 10⁷ Zellen werden mit 100 μl 4 °C PBS resuspendiert, 10 μl α-GalCer-beladenes CD1d-Tetramer-Phycoerythrin (CD1d Tetramer-PE) zugegeben und bei 4 ΰC 15 min im Dunkeln inkubiert.
   2. Waschen Sie die Zellen 2x mit PBS und resuspendieren Sie sie in 80 μL PBS.
   3. 20 μL Anti-PE-MicroBeads zugeben und bei 4 °C 20 min im Dunkeln inkubieren.
   4. Waschen Sie sie 2x mit PBS und resuspendieren Sie die Zellen mit 500 μL PBS.
   5. Stellen Sie die Sortiersäule in das Magnetfeld des MACS-Sortierers und spülen Sie sie mit 500 μL PBS.
   6. Geben Sie die Zellsuspension aus Schritt 1.3.4 in die Sortierkolonne, sammeln Sie den Durchfluss und spülen Sie 3x mit PBS-Puffer.
   7. Entfernen Sie das Magnetfeld und sammeln Sie die Zellen aus der Sortierspalte. Geben Sie zu diesem Zeitpunkt 1 ml PBS-Puffer in die Sortiersäule und drücken Sie den Kolben schnell mit konstantem Druck, um die markierten Zellen zum Sammelröhrchen zu treiben und gereinigte iNKT-Zellen zu erhalten. Zählen Sie mit einem automatischen Zellzähler.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Anti-PE-Mikroperlen	Miltenyi	Tel.: 130-048-801	Deutschland
Spalten	Miltenyi	Frau	Deutschland
Kryogene Zentrifuge	Beckman	Allegra® X-15R	Amerika
Maus CD1d Tetramer-PE	MBL	TS-MCD-1	Japan
Maus percoll	Solarbio	Nr. 8620	China
Lichtmikroskop	Olymp	Olympus-II	Japan