Eine ex vivo-Technik zur Herstellung chimärer Antigenrezeptor-T-Zellen

Zusammenfassung

Quelle: Ghassemi, S., et al. Herstellung von chimären Antigenrezeptor (CAR) T-Zellen für die adoptive Immuntherapie. J. Vis. exp. (2019)

Dieses Video demonstriert eine Technik zur Herstellung von chimären Antigenrezeptor (CAR) T-Zellen ex vivo. Menschliche T-Zellen werden mit magnetischen Kügelchen inkubiert, die mit Anti-CD3- und Anti-CD28-Antikörpern beschichtet sind, zusammen mit einem mit Interleukin-2 (IL-2) angereicherten Medium, was zu einer Aktivierung und Proliferation von T-Zellen führt. Transgene lentivirale Vektoren werden eingeführt, die es der transgenen RNA ermöglichen, sich in das Wirtsgenom zu integrieren und das Transgen zu exprimieren. Dies führt dazu, dass die transduzierten T-Zellen chimäre Antigenrezeptoren (CARs) auf ihrer Oberfläche exprimieren. Die T-Zellen werden zu definierten Zeitpunkten geerntet, um die CAR-Expression und die Kryokonservierung zu beurteilen.

Protokoll

Alle Verfahren, die die Probenentnahme beinhalten, wurden in Übereinstimmung mit den IRB-Richtlinien des Instituts durchgeführt.

>1. Aktivierung, Transduktion und Expansion von T-Zellen

1. Aktivieren Sie frische oder kryokonservierte primäre humane T-Zellen durch Mischen mit magnetischen Anti-CD3/CD28-Kügelchen (z. B. Dynabeads) in einem Verhältnis von 3 Kügelchen pro T-Zelle in 6-Well-Zellkulturschalen. Kultur-T-Zellen in X-VIVO 15 Medium, ergänzt mit 5 % normalem humanem AB-Serum, 2 mM L-Glutamin, 20 mM 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazineethansulfonsäure (HEPES) und Interleukin 2 (IL2, 100 Einheiten/ml). Halten Sie die T-Zellen während der Expansion in einer Konzentration von 10⁶ T-Zellen/ml. Kultivieren Sie T-Zellen bei 37 °C, 20 %_O2 und 95 % Luftfeuchtigkeit mit 5 % CO₂.
2. Nach der Stimulation über Nacht wird den aktivierten T-Zellen ein lentiviraler Überstand hinzugefügt. Berechnen Sie das Überstandsvolumen, das erforderlich ist, um eine Infektionsmultiplizität (MOI) von 3-5,
   zu erreichen Anmerkung: Das CD19-BBζ CAR-Lentivirus-Plasmid besteht aus einem CD8-Scharnier, einer 4-1BB-kostimulatorischen Domäne und einer CD3ζ-Signaldomäne. Der lentivirale Überstand CD19-BBζ wurde wie zuvor beschrieben erzeugt.
3. Entnehmen Sie an Tag 3 ein repräsentatives Aliquot von Zellen für die Kryokonservierung. Entfernen Sie vor der Kryokonservierung die magnetischen Kügelchen durch sanftes Pipettieren und magnetische Trennung. Bereiten Sie ein Gefriermedium vor, das phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) mit 0,5 % Dimethylsulfoxid (DMSO) enthält und bis zur Verwendung bei 4 °C gelagert wird.
   1. T-Zellen bei 300 x g für 5 min zentrifugieren. Den Überstand verwerfen und 5 ml PBS hinzufügen. Zellen bei 300 x g für 5 min zentrifugieren und das PBS verwerfen.
   2. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 1 mL kaltem Kryokonservierungsmedium. T-Zellen in einem gekühlten Gefrierbehälter einfrieren und bei -80 °C für 48 h lagern. Übertragen Sie die gefrorenen Zellen in flüssigen Stickstoff.
4. Waschen Sie den Rest der T-Zellen einmal in 5 ml PBS, um den Restvektor zu eliminieren. Bei 300 x g 5 min zentrifugieren. Dekantieren Sie das PBS und resuspendieren Sie das Zellpellet in einem T-Zell-Kulturmedium in einer Konzentration von 0,5 x 10⁶ Zellen/ml.
5. Teilen Sie die T-Zellen in zwei Kulturen auf, die für Tag 5 und Tag 9 vorgesehen sind. Zählen Sie T-Zellen mittels Durchflusszytometrie unter Verwendung von Zählbeads (Table of Materials) und monoklonalen Antikörpern gegen humanes CD4 und CD8 sowie einem Viabilitätsfarbstoff (Table of Materials).
   1. Um die T-Zellkonzentration zu messen, bereiten Sie einen Mastermix vor, der 500 μl PBS, 5 μl Zählbeads, 10 μl 7-Amino-Actinomycin-D-Zell-Viabilitätslösung, 4 μl CD4-Fluorescein-Isothiocyanat (FITC) und 4 μl CD8-Allophycocyanin (APC) enthält. Fügen Sie dem Mastermix 40 μl T-Zellen hinzu und messen Sie die Zellkonzentration mittels Durchflusszytometrie basierend auf der Anzahl der lebenden T-Zellen/Kügelchen. Refeeden, um die Kulturen jeden zweiten Tag in einer Konzentration von 0,5 x 10⁶ Zellen/ml zu halten.
6. Zählen und kryokonservieren Sie die Kulturen am Tag 5 wie in den Schritten 1.3 und 1.5 beschrieben.
7. An Tag 7 werden 0,5 x 10⁶ T-Zellen in PBS gewaschen und in 100 μl Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierpuffer (FACS) resuspendiert. Nachweis der Expression von CAR-Oberflächenproteinen durch Immunfärbung mit einem fluoreszierend konjugierten Anti-CAR19-Idiotypen durch Durchflusszytometrie.
8. Zählen Sie an Tag 9 die Kulturen am 9. Tag und kryokontieren Sie wie in Schritt 1.3 beschrieben.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Anti CD3/CD28 Dynabeads	Thermo Fischer	40203D
APC Maus Anti-Human CD8	BD Biowissenschaften	555369	RRID:AB_398595
APC-H7 Maus Anti-Human-CD8 Antikörper	BD Biowissenschaften	560179	RRID:AB_1645481
CountBright Absolute Zählperlen,	Invitrogen	Nr. C36950
HEPES	Gibco	Artikel-Nr.: 15630-080
Humanes AB-Serum	Valley Biomedical	HP1022
Humanes IL-2 IS, Premium-Qualität	Miltenyi	Tel.: 130-097-744
L-Glutamin	Gibco	Artikel-Nr.: 28030-081
Multisizer-Scharzähler	Beckman Coulter
X-VIVO 15	Gibco	04-418Q