Verbesserung der viralen Transduktion in natürlichen Killerzellen mit Hilfe eines kationischen Polymers

Zusammenfassung

Quelle: Nanbakhsh, A., et al. Dextran erhöht die lentivirale Transduktionseffizienz von primären NK-Zellen von Mäusen und Menschen. J. Vis. Exp. (2018).

Dieses Video zeigt einen Assay für die durch kationische Polymere vermittelte virale Transduktion in natürlichen Killerzellen (NK). Die Zellen werden mit transgenen Lentivirus-Vektoren inkubiert, die für ein fluoreszierendes Protein kodieren. Die Zugabe eines kationischen Polymers ermöglicht es dem Virus, sich an die Zellen anzuheften und seine RNA in das Wirtsgenom zu integrieren, wodurch das fluoreszierende Protein exprimiert wird. Die Fluoreszenz wird quantifiziert, um die polymerinduzierte Verstärkung der Transduktion zu beurteilen.

Protokoll

>1. Transduktion von murinen und humanen primären NK-Zellen mit Lentivirus

1. Suspendieren Sie primäre NK-Zellen von Mäusen oder Menschen in einer 24-Well-Platte bei 0,5 × 10⁵/ml Medium in Gegenwart eines Überstands des grün fluoreszierenden Proteins (GFP) bei einer Infektionsmehrheit (MOI) von 5, 10 und 20 und in Gegenwart von Pb (8 μg/ml), PS (8 μg/ml) oder Dextran (8 μg/ml).
2. Die Platten bei 1.000 × g 60 min zentrifugieren.
3. Ohne den Überstand zu dekantieren, werden die Zellen über Nacht (16-18 h) in einem 37 °C heißen Inkubator kultiviert, der mit 5,2 % CO₂ infundiert ist.
4. Mit 10 ml PBS waschen und in 2 ml vollständigem Kulturmedium des Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 in Gegenwart von Interleukin 2 (IL-2, 300 U/ml) resuspendieren.
5. Ernten Sie die transduzierten NK-Zellen an Tag 7, indem Sie vorsichtig auf die Kolben klopfen.
   1. Aktivieren Sie die geernteten Zellen mit titrierten Konzentrationen von plättchengebundenen anti-natürlichen Killergruppe 2D (NKG2D) (A10) mAb, indem Sie 96-Well-Polystyrolplatten mit hochgradig proteinabsorbierenden Polystyrolplatten über Nacht mit 2,5 μg/ml-Konzentrationen von anti-NKG2D-mAb beschichten.
   2. Waschen Sie jede Vertiefung dreimal mit 100 μl phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), bevor Sie primäre NK-Zellen hinzufügen.
6. Sammeln Sie Kulturüberstände mit einer Mehrkanalpipette zwischen 16 und 18 Stunden nach der Aktivierung, um Zytokine wie Interferon-gamma (IFN-γ) zu quantifizieren. Generieren Sie Standardkurven mit den rekombinanten Zytokinen, die mit ELISA-Kits (Enzyme-linked Immunosorbent Assay) geliefert werden.
7. Testen Sie die Lebensfähigkeit der NK-Zellen mit der Annexin-V/7-Amino-Actinomycin D (7-AAD)-Färbung und bestimmen Sie den Prozentsatz der nekrotischen Zellen unter den transformierten NK-Zellen mit einem Durchflusszytometer.
   1. Um diesen Assay durchzuführen, werden die murinen und humanen NK-Zellen vier Tage nach der Transduktion entnommen, zweimal mit 10 ml kaltem PBS bei 500 × g für jeweils 5 Minuten gewaschen und mit einem Annexin-V (PE)/7-AAD-Kit inkubiert.
8. Verwenden Sie eine geeignete Durchflusszytometrie-Software, um die Daten zu analysieren. Wählen Sie die lebende Zellpopulation aus und analysieren Sie die Expression von GFP (Fluorescein-Isothiocyanat-Kanal [FITC]) als Maß für die virale Transduktion.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Dextran	Sigma-Aldrich	Artikel-Nr.: 90-64-91-9
Polybren (Pb)	Sigma-Aldrich	TR-1003
Protaminsulfat (PS)	Sigma-Aldrich	Seite 3369
RPMI1640	Corning	10-040-CV
Interferon-Gamma (IFN-γ )	eBiowissenschaften	Tel.: 14-7311-85
Propidium-Lodid-Färbelösung	Bd	51-66211E
Lipofectamin 3000	Thermo Fischer	L3000015
Isofluran	Phönix	NDC 57319-559-05
293T Zellen	ATCC	CRL-3216
T75 Kolben	Corning	430641U
ELISA-Kits	Ebiowissenschaften	Tel.: 00-4201-56