Transfizierung von primären Makrophagen mit modifizierter mRNA

Zusammenfassung

Quelle: Herb, M. et al., Hocheffiziente Transfektion von primären Makrophagen mit in vitro transkribierter mRNA. J. Vis. (2019)

Dieses Video zeigt den Prozess der Transfektion von primären Makrophagen mit modifizierter mRNA, die für grün fluoreszierendes Protein kodiert. Diese modifizierten mRNAs, die die Immunogenität verringern und ihre Stabilität verbessern sollen, gewährleisten die erfolgreiche Transfektion und anschließende Expression von grün fluoreszierenden Proteinen, was durch Fluoreszenzmikroskopie bestätigt wird.

Protokoll

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

HINWEIS: Führen Sie alle Schritte mit Handschuhen aus. Führen Sie alle Transfektionsschritte unter einer Laminar-Flow-Haube durch, um eine Kontamination der Zellen zu verhindern. Reinigen Sie vor der Arbeit mit mRNA alle Instrumente wie Pipetten und jede Oberfläche mit 70 % Ethanol und/oder einem RNAse-abbauenden Tensid (Table of Materials). Stellen Sie sicher, dass alle Reaktionsgefäße RNAse-frei und steril sind. Verwenden Sie für Verdünnungen nur steriles, RNAase-freies Wasser. Verwenden Sie ausschließlich Pipettenspitzen mit Filtern. Wechseln Sie die Pipettenspitzen nach jedem Pipettierschritt.

>1. Generierung der DNA-Vorlage

HINWEIS: Das DNA-Template für die In-vitro-mRNA-Transkription unter Verwendung dieses Protokolls muss eine T7-Promotor-Sequenz enthalten, um das Andocken der RNA-Polymerase zu ermöglichen. Enthält das Plasmid, das die DNA-Sequenz des interessierenden Proteins enthält, bereits eine korrekt ausgerichtete T7-Promotorsequenz direkt vor der interessierenden Sequenz, muss eine Linearisierung des Plasmids (siehe Schritt 1.1.) durchgeführt werden. Andernfalls wird ein T7-Promotor durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR, siehe Schritt 1.2.) an die interessierende Sequenz angehängt.

1. Linearisierung von T7-Promotor-haltigen Plasmiden
   1. Linearisierung von Plasmiden, die bereits eine korrekt ausgerichtete T7-Promotorsequenz enthalten, durch Verdau mit einem Restriktionsenzym, das stromabwärts des Stoppcodons der interessierenden Sequenz schneidet. Andernfalls wird die Transkription nach der interessierenden Sequenz nicht ordnungsgemäß beendet.
      HINWEIS: Es ist am besten, Restriktionsenzyme zu verwenden, die stumpfe Enden oder 5-Zoll-Überhänge hinterlassen.
   2. Bestätigen Sie die vollständige Linearisierung des Plasmids durch Agarosegelelektrophorese von unverdauter und verdauter Plasmid-DNA.
   3. Aufreinigung linearisierter Plasmid-DNA vor der Verwendung als DNA-Template für die In-vitro-mRNA-Transkription mit einem DNA-Aufreinigungskit (Table of Materials).
2. Befestigung des T7-Promotors mittels PCR
   1. Verwenden Sie einen Forward-Primer, der die folgenden Komponenten enthält (in der angegebenen Reihenfolge von 5' bis 3'): etwa 5 zufällige bp stromaufwärts des Promotors (z. B. GAAAT); die T7-Promotorsequenz (TAATACGACTCACTATAG); zwei zusätzliche Gs für eine erhöhte Transkriptionseffizienz (GG); der zielsequenzspezifische Teil, der homolog zu der Plasmidsequenz ist, die das Startcodon umgibt.
      Anmerkung: Es sollte sich zusammensetzen aus 3-6 bp stromaufwärts der KOZAK-Sequenz und dem Startcodon, der KOZAK-Sequenz und dem Startcodon (in der Regel GCCACC ATG G), 12-18 bp stromabwärts des Startcodons. Wenn die interessierende Sequenz nicht bereits eine KOZAK-Sequenz oder ein Startcodon enthält, können diese in diesem Schritt einfach angehängt werden, indem sie einfach in die Primersequenz aufgenommen werden.
   2. Die t_m des Vorwärtsprimers wird nur unter Berücksichtigung des Teils berechnet, der der Zielsequenz homolog ist.
   3. Zur Beurteilung der Dimer-/Haarnadelbildung wird die gesamte Primersequenz verwendet, die leicht 50 bp überschreiten kann.
   4. Verwenden Sie eine umgekehrte Grundierung, die sich irgendwo unterhalb des Stoppcodons befindet.
      HINWEIS: Wenn die gewünschte Sequenz noch kein Stoppcodon enthält, kann es in diesem Schritt angehängt werden, indem es einfach in die Primersequenz aufgenommen wird.
   5. Verwenden Sie die Vorwärts- und Rückwärtsprimer, um eine PCR mit einer High-Fidelity-Polymerase mit Korrekturlesen durchzuführen (Materialtabelle).
   6. Bestätigen Sie die Erzeugung eines einzelnen Produkts und der Amplikongröße durch Agarosegelelektrophorese (z. B. verwenden Sie ein 1%iges Agarosegel und einen konstanten Strom von 100 V).
   7. Reinigen Sie das PCR-Produkt vor der Verwendung als Desoxyribonukleinsäure (DNA)-Template für die In-vitro-Transkription von Boten-Ribonukleinsäure (mRNA) mit einem DNA-Aufreinigungskit.

>2. mRNA-Erzeugung

1. Tauen Sie alle Komponenten des In-vitro-mRNA-Transkriptionskits auf (siehe Materialtabelle). Vortex für 5 s und Spin down für 2 s bei 2.000 x g. Bis zur Verwendung auf Eis aufbewahren.
2. Bereiten Sie den Reaktionsmix für die In-vitro-mRNA-Transkription in einem 0,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen in der folgenden Reihenfolge vor (Gesamtvolumen von 40 μl): 20 μl 10x Anti-Reverse-Cap-Analoga/Nukleosidtriphosphat (ARCA/NTP)-Mix (im In-vitro-mRNA-Transkriptionskit enthalten); 0,25 μl 5-Methyl-Cytidin-Triphosphat (5-mCTP) (Endkonzentration (fc) beträgt 1,25 mM; 50 % des Gesamt-CTP); 0,25 μl Pseudo-Uridin-Triphosphat (Pseudo-UTP) (f.c. ist 1,25 Mm; 50 % der gesamten unlauteren Handelspraktiken); X μL DNA-Matrize; 2 μl T7-RNA-Polymerase-Mix (im In-vitro-mRNA-Transkriptionskit enthalten); Y μL_{RNAse-freies H 2}O.
   HINWEIS: X ist ein Volumen, das mindestens 1 μg DNA enthält. Zum Beispiel 1,6 μl aus einer 625 ng/μl Stammlösung. Y ist das Ersatzvolumen für das Gesamtvolumen von 40 μL.
3. Vortex für 5 s und Spin down für 2 s bei 2.000 x g. Inkubieren Sie bei 37 °C für 30 min bei 400 U/min auf einem thermischen Mischer für die In-vitro-Transkription.
4. Geben Sie dann 2 μl DNase I direkt in die Reaktionsmischung, um die Matrizen-DNA zu entfernen. Vortex für 5 s und Spin down für 2 s bei 2.000 x g.
Bei
5. 37 °C für 15 min bei 400 U/min auf einem Thermomischer inkubieren. Nehmen Sie ein Aliquot von 2 μl für das Kontrollgel (Schritt 3.3) und lagern Sie es bei -80 °C.
6. Für das Poly(A)-Tailing fügen Sie die folgenden Komponenten direkt in die vorherige Reaktionsmischung hinzu (bis zu einem Endvolumen von 50 μl): 5 μl 10x Poly(A)-Polymerase-Reaktionspuffer und 5 μl Poly(A)-Polymerase (beide im In-vitro-mRNA-Transkriptionskit enthalten). Vortex für 5 s und Spin down für 2 s bei 2.000 x g.
7. Die Mischung bei 37 °C für 30 min bei 400 U/min auf einem Thermomixer inkubieren. Nehmen Sie ein Aliquot von 2 μl für das Kontrollgel (Schritt 3.3) und lagern Sie es bei -80 °C.
8. Zur Dephosphorylierung der 5'-Enden der mRNA fügen Sie die folgenden Komponenten direkt in den vorherigen Reaktionsmix hinzu (bis zu einem Endvolumen von 60 μl): 3 μl RNAse-freies H₂O; 6 μl 10x antarktischer Phosphatase-Reaktionspuffer; 3 μl antarktische Phosphatase (15 Einheiten für 60 μl Reaktionsvolumen). Vortex für 5 s und Spin down für 2 s bei 2.000 x g.
9. Die Mischung wird bei 37 °C für 30 min bei 400 U/min auf einem Thermomischer inkubiert.
10. Hitzeinaktivierte antarktische Phosphatase durch Inkubation bei 80 °C für 2 min.
    Anmerkung: Verwenden Sie idealerweise einen separaten Thermomischer, warten Sie nicht, bis der erste Mischer die gewünschte Temperatur erreicht hat.

>3. mRNA-Aufreinigung

1. Aufreinigung der in vitro transkribierten mRNA mit einem speziellen RNA-Aufreinigungskit (Table of Materials).
   1. Geben Sie X μl Elutionslösung in das mRNA-Reaktionsgemisch aus Schritt 2.10. Mischen, indem Sie 5 Mal umdrehen. Fügen Sie 300 μl Bindelösungskonzentrat hinzu. Durch leichtes Pipettieren 5 Mal mischen.
      HINWEIS: X ist das Ersatzvolumen bis zu einem Gesamtvolumen von 100 μl. Fügen Sie beispielsweise 40 μl Elutionslösung zu einem 60 μl mRNA-Reaktionsgemisch hinzu.
   2. 100 μl RNAase-freies Ethanol hinzufügen. Mischen Sie durch vorsichtiges 5-maliges Pipettieren.
   3. Setzen Sie eine Filtersäule in eines der mitgelieferten Auffangröhrchen ein. Übertragen Sie das mRNA-Reaktionsgemisch vorsichtig auf die Mitte des Filters, ohne den Filter zu berühren. Zentrifugieren Sie bei 15.000 x g für 1 min bei Raumtemperatur (RT).
   4. Heben Sie die Filtersäule vorsichtig an und entsorgen Sie den Durchfluss im Auffangrohr. Setzen Sie die Filtersäule wieder in das gleiche Auffangrohr ein.
   5. Fügen Sie 500 μl Waschlösung hinzu (vergessen Sie nicht, 20 ml RNAase-freies Ethanol hinzuzufügen, bevor Sie die Waschlösung zum ersten Mal verwenden).
   6. Bei 15.000 x g 1 min bei RT zentrifugieren. Die Schritte 3.1.4-3.1.6 wiederholen, um noch einmal zu waschen.
   7. Zentrifugieren Sie 1 Minute lang bei voller Drehzahl (17.900 x g) bei RT, um jegliche Restflüssigkeit aus der Filtersäule zu entfernen. Entnehmen Sie die Filtersäule vorsichtig aus dem Auffangrohr. Setzen Sie die Filtersäule in ein neues Auffangröhrchen ein.
   8. Geben Sie 50 μl Elutionspuffer in die Mitte des Filters, ohne den Filter zu berühren. Bei 65 °C für 10 min auf einem Thermomischer inkubieren.
   9. Zentrifugieren Sie bei 15.000 x g für 1 min bei RT. Entfernen Sie die Filtersäule und entsorgen Sie sie.
2. Messen Sie die Konzentration und Reinheit der eluierten mRNA, z. B. mit einem Mikrovolumen-Spektrophotometer, um die Absorption bei 260 und 280 nm zu messen.
   HINWEIS: Ein A260/A280-Verhältnis von 1,8-2,1 ist ein Hinweis auf hochreine mRNA
.
3. Überprüfen Sie das Vorhandensein eines einzelnen Produkts, die korrekte Transkriptlänge und das Poly(A)-Tailing, indem Sie die Aliquote aus den Schritten 2.5 und 2.7 durch Agarosegelelektrophorese unter denaturierenden Bedingungen analysieren (verwenden Sie z. B. ein 1,2 %iges Agarosegel, das 20 mM 3-(N-Morpholinos)propansulfonsäure [MOPS], 5 mM Natriumacetat, 1 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) und 20 % Formaldehyd enthält, und führen Sie es in 20 mM MOPS durch. 5 mM Natriumacetat, 1 mM EDTA und 0,74 % Formaldehyd bei 100 V Konstantstrom).
4. Lagern Sie die gereinigte mRNA bis zur Transfektion im Elutionsröhrchen bei -80 °C. Wenn nur geringe Mengen der mRNA für die Transfektion verwendet werden, aliquotieren Sie die mRNA, um wiederholte Frost-Tau-Zyklen zu vermeiden.
   HINWEIS: mRNA kann ca. 1 Jahr bei -80 °C gelagert werden.

>4. Vorbereitung von Makrophagen

1. Euthanasieren von C57/BL6-Mäusen (Verwendung von Mäusen des gleichen Geschlechts und im Alter von 6-24 Wochen) durch Zervixluxation.
   HINWEIS: Dieselben Mäuse können für die Isolierung von primären Makrophagen (PM) (Schritt 4.2) und die Erzeugung von BMDM (Schritte 4.3 und 4.4) verwendet werden. Zur Isolierung von PM verwenden Sie mindestens zwei Mäuse. Sollen nur BMDM erzeugt werden, reicht in der Regel eine Maus aus.
2. Immunmagnetische Anreicherung von Peritonealmakrophagen.
   1. Füllen Sie eine 10 mL Spritze mit einer 0,9 x 40 mm Kanüle mit 8 mL eiskalter phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und 2 mL Luft. Spülen Sie die Bauchhöhle mit PBS. Die Luft bildet eine Blase, die das Austreten des PBS minimiert.
   2. Sammeln Sie schnell eine Peritonealspülung mit derselben Spritze und überführen Sie sie in ein konisches 50-ml-Zentrifugationsröhrchen. Kombinieren Sie bei Bedarf Peritonealzellen mehrerer Mäuse. Bewahren Sie die Zellsuspension auf Eis auf.
   3. Zellsuspension bei 650 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren. Den Überstand verwerfen und das Zellpellet in 5 mL mit 0,2 % NaCl für 30 s resuspendieren, um die roten Blutkörperchen zu lysieren.
   4. Fügen Sie 5 ml 1,6 % NaCl zu einem Gesamtvolumen von 10 ml hinzu, um isotonische Bedingungen zu rekonstituieren. Zentrifugieren Sie bei 650 x g für 5 min bei 4 °C.
   5. Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 97,5 μl MCS-Puffer (Magnetic Cell Sorting (MCS) (2 mM Ethylendiamintetraessigsäure [EDTA], 0,5 % Rinderserumalbumin [BSA] in PBS) pro 1 Peritonealspülung (z. B. wenn drei Mäuse gespült wurden, resuspendieren Sie in 292,5 μl).
   6. Fügen Sie 2,5 μl paramagnetische Beads hinzu, die an einen CD11b-spezifischen Antikörper konjugiert sind, pro 97,5 μl Zellsuspension (z. B. fügen Sie 7,5 μl zu 292,5 μl hinzu).
   7. 15 min bei 150 U/min auf einem Orbitalschüttler auf Eis inkubieren.
   8. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 650 x g für 5 min bei 4 °C, verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 1 mL MCS-Puffer.
   9. Fügen Sie 4 ml MCS-Puffer zu einem Gesamtvolumen von 5 ml hinzu und waschen Sie die Zellen, indem Sie dreimal vorsichtig auf und ab pipettieren.
   10. Wiederholen Sie die Schritte 4.2.8 und 4.2.9 noch zweimal, um insgesamt drei Waschschritte zu erhalten.
   11. Platzieren Sie während der Waschschritte eine LS-Säule in einem magnetischen Zellseparator (siehe Materialtabelle). Spülen Sie die Säule mit 3 mL MCS-Puffer.
       Anmerkung: Vermeiden Sie Blasen, da diese die Säule verstopfen können.
   12. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 1 ml MCS-Puffer. Fügen Sie 3 ml MCS-Puffer zu einem Gesamtvolumen von 4 ml hinzu und mischen Sie, indem Sie dreimal auf und ab pipettieren.
   13. Übertragen Sie die 4 mL der Zellsuspension auf die gespülte LS-Säule.
       HINWEIS: Vermeiden Sie auch hier Blasen, da diese die Säule verstopfen können.
   14. Warten Sie, bis das Reservoir der Säule vollständig leer ist. Fügen Sie keine zusätzliche Flüssigkeit hinzu, bis die Säule aufhört zu tropfen.
   15. Fügen Sie der Säule 3 ml MCS-Puffer hinzu. Warten Sie dann, bis das Reservoir der Säule vollständig leer ist. Wiederholen Sie Schritt 4.2.15 noch zwei weitere Male.
   16. Setzen Sie die LS-Säule in ein konisches 15-ml-Zentrifugationsröhrchen ein. Tragen Sie 5 mL MCS-Puffer auf die Säule auf. Warten Sie, bis 2 ml Flüssigkeit durch die Säule geflossen sind, und drücken Sie dann mit dem Kolben die verbleibende Fraktion vorsichtig in das Röhrchen.
   17. Die Zellsuspension bei 650 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren und den Überstand verwerfen.
   18. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 1 ml Modifiziertem Eagle Medium (DMEM) von Dulbecco, ergänzt mit 10 % hitzeinaktiviertem fötalem Kälberserum (FCS) (DMEM+FCS).
   19. Bestimmen Sie die Anzahl lebensfähiger Zellen durch Zählen in Trypanblau-Lösung in einer Neubauer-Zählkammer und der Keimzellen in DMEM+FCS in Kulturplatten.
       HINWEIS: PM mit einer Dichte von 100.000 Zellen/Well in einer Mikrotiterplatte mit flachem Boden aussäen. Verwenden Sie keine mit Gewebekulturen behandelten Platten, da sich PM nicht von diesen lösen lässt. Verwenden Sie stattdessen unbehandelte Platten.
3. Generierung von BMDM
   1. Entferne Haut und Muskeln von den Hinterbeinen mit einer Schere. Waschen Sie jedes Bein durch kurzes Eintauchen in 70%iges Ethanol.
   2. Löse die Beine und öffne beide Enden des Oberschenkelknochens und des Schienbeins, indem du mit einer Schere schneidest.
   3. Füllen Sie eine 5-ml-Spritze, die mit einer 0,6 mm x 30 mm-Kanüle gefüllt ist, mit 5 mL sehr niedrigem Endotoxin (VLE) RPMI 1640 und spülen Sie das Knochenmark aus den geöffneten Knochen in eine Kulturschale.
   4. Kombinieren Sie bei Bedarf das Knochenmark mehrerer Mäuse, indem Sie die Schritte 4.3.1 bis 4.3.3 wiederholen. Übertragen Sie das Knochenmark in ein konisches 50-ml-Zentrifugationsröhrchen.
   5. Die Knochenmarksuspension bei 650 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren und den Überstand verwerfen.
   6. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 5 ml Puffer für die Lyse roter Blutkörperchen (8,3 % Ammoniumchlorid, NH₄Cl, 0,1 M Tris) und inkubieren Sie es 5 Minuten lang bei RT, um die roten Blutkörperchen zu lysieren.
   7. Die Zellsuspension wird bei 650 x g bei 4° C 5 min lang zentrifugiert und der Überstand verworfen.
   8. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 1 ml VLE Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium, ergänzt mit 10 % FCS, 1 % Penicillin/Streptomycin, 1 % HEPES, 1 % Natriumpyruvat und 10 ng/ml rekombinantem Makrophagen-Kolonie-stimulierendem Faktor (M-CSF) (RPMI+++++).
   9. Fügen Sie 4 ml RPMI+++++ zu einem Gesamtvolumen von 5 ml hinzu.
   10. Bereiten Sie 5 unbehandelte Petrischalen 92 mm x 16 mm mit Nocken (siehe Materialtabelle) pro Maus vor, indem Sie 7 ml RPMI+++++ Medium in jede Schale pipettieren.
   11. 1 ml Zelllösung in die 5 vorbereiteten Kulturschalen geben und bei 37 °C und 5 % CO₂ inkubieren.
   12. Füttern Sie die Zellen nach 4 Tagen mit 4 ml RPMI+++++. Nach 6-7 Tagen sind die Knochenmarkzellen vollständig zu BMDM differenziert.
4. Ernte von BMDM
   1. Entfernen Sie das Medium vollständig aus den Kulturschalen. Geben Sie 5 ml warme 0,2 mM EDTA in PBS in jede Schale.
   2. Kratzen Sie die gesamte Platte vorsichtig mit einem Zellschaber ab, um das BMDM zu lösen. Kombinieren Sie die Zellsuspensionen in einem konischen 50-ml-Zentrifugationsröhrchen.
   3. Spülen Sie alle 5 Schalen erneut. Verwenden Sie für alle 5 Gerichte das gleiche Volumen von 5 ml warmem 0,2 mM EDTA in PBS. Kombinieren Sie diese Zellsuspension mit der Suspension aus dem vorherigen Schritt.
   4. Die Zellsuspension bei 650 x g für 5 min bei 4° C zentrifugieren und den Überstand verwerfen.
   5. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 1 ml VLE RPMI 1640 Medium, ergänzt mit 10 % FCS, 1 % HEPES, 1 % Natriumpyruvat und 10 ng/ml rekombinantem M-CSF, aber ohne Antibiotika (RPMI⁺⁺++).
   6. Bestimmen Sie die Anzahl lebensfähiger Zellen durch Einzählen in Trypanblau-Lösung in einer Neubauer-Zählkammer und der Keimzellen in RPMI⁺⁺⁺⁺ in Kulturplatten.
      Anmerkung: BMDM mit einer Dichte von maximal 50.000 Zellen/Vertiefung in einer Mikrotiterplatte mit flachem Boden aussäen. Verwenden Sie keine mit Gewebekulturen behandelten Platten, da sich BMDM kaum von diesen lösen lässt. Verwenden Sie stattdessen unbehandelte Platten.

>5. Transfektion von Makrophagen mit mRNA

1. Berechnen Sie das erforderliche Volumen des mRNA-Transfektionspuffers.
   Anmerkung: Das Volumen des erforderlichen mRNA-Transfektionspuffers hängt von der Well-Größe ab: Verwenden Sie 200 μl für die Transfektion in einer 6-Well-Platte, 100 μl in einer 12-Well-Platte und so weiter. Fügen Sie immer ein wenig zusätzliches Volumen hinzu, da das Pipettieren verloren geht (aber nicht zu viel, um eine übermäßige Verdünnung der mRNA zu vermeiden). Verwenden Sie beispielsweise 450 μl anstelle von 4 x 100 μl = 400 μl, um in 4 Vertiefungen einer 12-Well-Platte zu transfizieren.
2. Berechnen Sie das erforderliche Volumen des mRNA-Transfektionsreagenzes. Das mRNA-Transfektionsreagenz wird im Verhältnis 1:50 zugegeben. Zum Beispiel sind 9 μl mRNA-Transfektionsreagenz für ein Endvolumen von 450 μl erforderlich.
3. Berechnen Sie die Gesamtmenge an benötigter mRNA. Mindestens 100 ng pro 100.000 Makrophagen sind für eine effiziente Transfektion erforderlich, 200 ng funktionieren sogar noch besser (z. B. 800 ng mRNA zur Transfektion von 400.000 Makrophagen).
   1. Multiplizieren Sie die berechnete Menge an benötigter mRNA mit der Gesamtzahl der Wells, die transfiziert werden müssen (z.B. 4 Wells mit je 400.000 Makrophagen: 4 x 800 ng = 3.200 ng mRNA werden insgesamt für alle Wells benötigt). Wenn Ihr mRNA-Bestand beispielsweise 426,8 ng/μl beträgt, werden 7,49 μl für eine optimale Transfektion von 4 Wells mit jeweils 400.000 Makrophagen benötigt.
4. Das berechnete Volumen des mRNA-Transfektionspuffers (Schritt 5.1.) abzüglich der Volumina für das mRNA-Transfektionsreagenz (Schritt 5.2) und die mRNA (Schritt 5.3) wird in ein Reaktionsgefäß gegeben. Beispiel: 450 μL - 9 μL - 7,49 μL = 433,51 μL.
5. Tauen Sie den mRNA-Stamm auf und mischen Sie ihn durch vorsichtiges Wenden des Elutionsröhrchens. Geben Sie das berechnete mRNA-Volumen (Schritt 5.3) in das Reaktionsgefäß mit mRNA-Reaktionspuffer (im oben dargestellten Beispiel: 7,49 μL in 433,51 μL).
6. Vortex für 5 s und Spin down für 2 s bei 2.000 x g.
7. Vortex das mRNA-Transfektionsreagenz für 5 s und Spin-down für 2 s bei 2.000 x g.
8. Das berechnete Volumen des mRNA-Transfektionsreagenzes (Schritt 5.2) wird in das Reaktionsröhrchen gegeben, das den mRNA-Transfektionspuffer und die mRNA enthält (im obigen Beispiel: 9 μl mRNA-Transfektionsreagenz).
9. Den Transfektionsmix 5 s lang vortexen und 2 s bei 2.000 x g nach unten schleudern.
10. 15 min bei RT inkubieren.
11. In der Zwischenzeit wird das Nährmedium der Makrophagen durch ein frisches, warmes Kulturmedium ersetzt (siehe Schritte 4.2.18 und 4.4.5).
12. Nach dem Inkubationsschritt 5.10 wird die Transfektionsmischung in die Vertiefungen mit den Makrophagen in einem für die Größe der Vertiefung geeigneten Volumen gegeben (siehe Schritt 5.1). Die Transfektionsmischung tropfenweise in einem Kreis von außen zur Mitte der Vertiefung hinzufügen.
13. Schütteln Sie die Platte vorsichtig, zuerst in vertikaler und dann in horizontaler Richtung, um eine gleichmäßige Verteilung der Transfektionsmischung in der Vertiefung zu gewährleisten. Anschließend bei 37 °C und 5 % CO₂ inkubieren. Die Synthese des Proteins, das von der transfizierten mRNA kodiert wird, beginnt kurz nach der Transfektion. Für beste Ergebnisse mindestens 6 Stunden inkubieren.
14. Analysieren Sie nach der Inkubation die Transfektionseffizienz durch (Immun-)Fluoreszenzmikroskopie, Durchflusszytometrie oder Immunoblot oder verwenden Sie die transfizierten Makrophagen für das Experiment Ihrer Wahl.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
5-Methyl-CTP (100 mM)	Jena Biosience	NU-1138S	gelagert bei -20 °C
Antarktische Phosphatase	New England BioLabs	Nr. M0289	gelagert bei -20 °C
Antarktischer Phosphatase-Reaktionspuffer (10X)	New England BioLabs	Nr. B0289	gelagert bei -20 °C
Anti-NEMO/IKKγ-Antikörper	Invitrogen	MA1-41046	gelagert bei -20 °C
Anti-β-Aktin-Antikörper	Sigma-Aldrich	Nr. A2228	gelagert bei -20 °C
Petrischalen 92,16 mm mit Nocken	Sarstedt	8,21,473	gespeichert bei RT
CD11b Mikrokügelchen Maus und Mensch	Miltenyi Biotec	Tel.: 130-049-601	gelagert bei 4 °C
Cre-Rekombinase + T7-Promotor Forward Primer	Sigma-Aldrich		5′-GAAATTAATACGACTCACTATA GGGGCAGCCGCCACCATGTCC AATTTACTGACCGTAC-3', gelagert bei -20 °C
Cre-Rekombinase + T7-Promotor Reverse Primer	Sigma-Aldrich		5′-CTAATCGCCATCTTCCAGCAGG C-3′, gelagert bei -20 °C
DNA-Aufreinigungskit: QIAquick PCR-Aufreinigungskit	Qiagen	Artikel-Nr.: 28104	gespeichert bei RT
eGFP + T7-Promotor Vorwärtsprimer	Sigma-Aldrich		5'-GAAATTAATACGACTCACTATA GGGATCCATCGCCACCATGGTG AGCAAGG-3', gelagert bei -20 °C
eGFP + T7-Promotor Rückgrundierung	Sigma-Aldrich		5'-TGGTATGGCTGATTA TGATCTAGAGTCG-3', gelagert bei -20 °C
Schneller Verdau-Puffer (10X)	Thermo Scientific	Nr. B64	gelagert bei -20 °C
FastDigest XbaI	Thermo Scientific	Nr. FD0684	gelagert bei -20 °C
High-Fidelity-Polymerase mit Korrekturlesen: Q5 High-Fidelity DNA-Polymerase	New England Biolabs Inc	M0491S	gelagert bei -20 °C
IKKβ + T7-Promotor Vorwärts-Grundierung	Sigma-Aldrich		5′-GAAATTAATACGACTCACTATA GGGTTGATCTACCATGGACTACA AAGACG-3′, gelagert bei -20 °C
IKKβ + T7-Promotor Rückgrundierung	Sigma-Aldrich		5′-GAGGAAGCGAGAGCT-CCATCTG-3′, gelagert bei -20 °C
in vitro mRNA-Transkriptionskit: HiScribe T7 ARCA mRNA Kit (mit polyA-Tailing)	New England BioLabs	Nr. E2060	gelagert bei -20 °C
LS-Säulen	Miltenyi Biotec	Tel.: 130-042-401	gespeichert bei RT
MACS MultiStand	Miltenyi Biotec	Tel.: 130-042-303	gespeichert bei RT
mRNA-Transfektionspuffer und Reagenz: jetMESSENGER	Polyplus-Transfektion	409-0001DE	gelagert bei 4 °C
Mutante IKKβ IKK-2S177/181E Plasmid	Addgene	Nr. 11105	gelagert bei -20 °C
Mutant NEMOC54/347A Plasmid	Addgene	Artikel-Nr.: 27268	gelagert bei -20 °C
pEGFP-N3-Plasmid	Addgene	Artikel-Nr.: 62043	gelagert bei -20 °C
Poly(I:C)	Calbiochem	528906	gelagert bei -20 °C
pPGK-Cre-Plasmid			F. T. Wunderlich, H. Wildner, K. Rajewsky, F. Edenhofer, Neue Varianten der induzierbaren Cre-Rekombinase: Eine neuartige Mutante des Cre-PR-Fusionsproteins weist eine erhöhte Sensitivität und einen erweiterten Bereich der Induzierbarkeit auf. Nukleinsäuren Res. 29, 47e (2001). gelagert bei -20 °C
Pseudo-UTP (100 mM)	Jena Biosience	NU-1139S	gelagert bei -20 °C
QuadroMACS-Abscheider	Miltenyi Biotec	Tel.: 130-090-976	gespeichert bei RT
Ratten-Anti-Maus-CD11b-Antikörper, APC-konjugiert	BioLegende	101212	gelagert bei 4 °C
Ratten-Anti-Maus F4/80 Antikörper, PE-konjugiert	eBiowissenschaften	Tel.: 12-4801-82	gelagert bei 4 °C
rekombinantes M-CSF	Peprotech	315-02	gelagert bei -20 °C
RNA-Aufreinigungskit: MEGAclear Transkriptions-Clean-up-Kit	ThermoFisher Scientific	AM1908	gelagert bei 4 °C
RNAse-abbauendes Tensid: RnaseZAP	Sigma-Aldrich	Nr. R2020	gespeichert bei RT
Hochreines LPS aus E.coli O111:B4	Invivogen		gelagert bei -20 °C
Wildtyp-IKKβ-Plasmid	Addgene	Artikel-Nr.: 11103	gelagert bei -20 °C
Wildtyp-NEMO-Plasmid	Addgene	Artikel-Nr.: 27268	gelagert bei -20 °C