HINWEIS: Das folgende Protokoll beschreibt die notwendigen Schritte zur Eliminierung bestimmter Zellen mittels Nahinfrarot-Photoimmuntherapie (NIR-PIT). Kontrollen und andere Details zu NIR-PIT und Zellviabilität finden Sie an anderer Stelle.
>1. Konjugation von Infrarot 700 (IR700) an monoklonale Antikörper (mAb)
- Bereiten Sie den gewünschten mAb in einer Dosis von 2-5 mg/ml in 0,1 M Dinatriumhydrogenphosphat (Na2HPO4) (pH 8,6) Lösung vor.
- Mischen Sie 6,8 nmol mAb mit 30,8 nmol 10 mM IR700 in 0,1 M Na2HPO4 Lösung (pH 8,6) in einem Mikrozentrifugenröhrchen und inkubieren Sie 1 Stunde lang bei RT, bedeckt mit Aluminiumfolie.
- Waschen Sie die PD-10-Säule (siehe Tabelle der Materialien/Ausrüstung) zweimal mit 15 ml PBS. Laden Sie die Probe aus Schritt 1.2.
- Reinigen Sie das Gemisch über die PD-10-Säule durch PBS-Elution gemäß den Herstellerangaben.
HINWEIS: Hier erfolgte die Elution entlang der Bandfarbe von IR700. Bei einer Probe von 300 μl liegt die PBS-Elutionsfraktion typischerweise zwischen 2,5 ml und 4,4 ml.
- Bestimmen Sie die Proteinkonzentration mit der Coomassie-Färbung, indem Sie die Absorption bei 595 nm mit einem Spektralphotometer messen. Bestimmen Sie die Konzentration von IR700 mit Absorption bei 689 nm, um die Anzahl der Fluorophormoleküle zu bestätigen, die an jedes mAb-Molekül konjugiert sind.
HINWEIS: Es ist wichtig, eine optimale Konjugationszahl von IR700-Molekülen in 1 mAb mit einem Spektralphotometer zu bestimmen. Im Allgemeinen sind etwa 3 IR700-Moleküle in 1 mAb-Molekül sowohl für die In-vitro- als auch für die In-vivo-Arbeit optimal. Mit Hilfe der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) und der Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) kann bestätigt werden, ob mAb und IR700 gebunden sind oder nicht.
- Nach Bestimmung der Proteinkonzentration bei 4 °C lagern.
>2. Vorbereitung einer gemischten 3D-Zellkultur (gemischtes Sphäroide)
- Tragen Sie steriles Wasser (ca. 1 ml) in den Plattenbehälterbereich der hängenden Fallplatten auf.
- Bereiten Sie verschiedene Verhältnisse der interessierenden Zelltypen vor – A431-Luciferase-grün fluoreszierendes Protein (A431-luc-GFP)-Zellen und 3T3-rot fluoreszierendes Protein (3T3-RFP)-Zellen –, wobei jede Probe insgesamt 5.000 Zellen enthält, die in 50 μl Kulturmedium suspendiert sind.
HINWEIS: Bereiten Sie je nach Zelltyp die Verhältnisse 1:100, 10:100, 25:100, 50:100 usw. der Zelltypen vor, die in Kulturmedien von Interesse sind.
- Inkubieren Sie die Mischung 5-7 Tage lang in der 96 Brunnen hängenden Fallplatte in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C und 5 % Kohlendioxid. Wechseln Sie den Nährboden alle 2 Tage. HINWEIS: Um das 3D-Sphäroid präzise herzustellen, gehen Sie vorsichtig mit der Platte um, da Tropfen, die Zellen enthalten, leicht abfallen, bevor sie 3D-Formen bilden.
- Beobachten Sie die Morphologie und Größe der Sphäroide mit einem inversen Hellfeldmikroskop bei 10- bis 40-facher Vergrößerung. HINWEIS: Obwohl es vom Zelltyp und der Größe des hängenden Tropfens abhängt, stellen Sie sicher, dass der Durchmesser des Sphäroids nach 7 Tagen Inkubation in der 96-Well-Hängetropfplatte etwa 400-600 μm beträgt.
>3. In vitro NIR-PIT für gemischte 3D-Zellkulturen
- Wechseln Sie das Medium der hängenden Fallplatten auf 10 μg/ml Antikörper-Photoabsorber-Konjugat (APC), das Medien enthält, und inkubieren Sie es 6 Stunden lang in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C und 5 % Kohlendioxid.
- Nach 6-stündiger Inkubation waschen Sie das Sphäroid zweimal mit frischem Nährmedium (phenolrotfrei). Das Sphäroid wird vorsichtig in eine 50-mm-Schale mit 100 μl frischem phenolrotfreiem Nährmedium mit einer sterilen 200-μl-Pipettenspitze überführt, wobei die Spitze abgeschnitten wird. Geben Sie ein Sphäroid in jede Schale.
- Beobachten Sie das Sphäroid mit einem inversen Hellfeldmikroskop, um die Veränderung der Morphologie zu erkennen. Um die optischen Reporter (z. B. GFP und RFP) zu beobachten, verwenden Sie ein Fluoreszenzmikroskop mit den folgenden Filtereinstellungen: GFP - 469 nm Anregungsfilter und 525 nm Emissionsfilter; RFP — 559 nm Anregungsfilter und 630 nm Emissionsfilter.
- Platzieren Sie die Leuchtdiode (LED) über der Glasschale für die Bestrahlung.
HINWEIS: Sphäroide können entweder am Mikroskop oder in der Laminarhaube NIR-Licht ausgesetzt werden.
- Messen Sie die Leistungsdichte des NIR-Lichts mit einem optischen Leistungsmesser. Nach dieser Messung wird NIR-Licht über Leuchtdioden (LEDs) abgestrahlt, die Licht bei Wellenlängen von 670 bis 710 nm bei 2 J/cm2,
HINWEIS: LED-Licht kann eine maximale Tiefe von ca. 5 Zoll durchdringen. Die zytotoxische Wirkung von NIR-PIT hängt unabhängig von der Leistungsdichte und der Dauer der Exposition nur von der gegebenen Energie ab.
- Nach der Bestrahlung wird das Sphäroid in eine neue hängende Tropfplatte mit 50 μl frischem Nährmedium überführt und 1 Tag lang in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C und 5 % Kohlendioxid inkubiert.
- Übertragen Sie das Sphäroid vorsichtig in eine Schale mit 100 μl frischem Nährmedium (phenolrotfrei) unter Verwendung einer sterilen 200-μl-Pipettenspitze, wobei die Spitze abgeschnitten ist. Beobachten Sie das Sphäroid 1 Tag nach der NIR-PIT mit einem Fluoreszenzmikroskop unter Verwendung der in Schritt 3.3 beschriebenen Filtereinstellungen.
- Detektieren Sie tote Zellen durch Zugabe von Propidiumiodid zu den Medien in einer Endkonzentration von 2 μg/ml oder durch Verlust der zytoplasmatischen GFP-Fluoreszenz mit einem Fluoreszenzmikroskop (Abbildung 1B).
- Wiederholen Sie die Schritte 3.1-3.6, wenn die Zielzellen nicht vollständig entfernt wurden.
