Alle Verfahren, die die Probenentnahme beinhalten, wurden in Übereinstimmung mit den IRB-Richtlinien des Instituts durchgeführt. Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom örtlichen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. Erzeugung von HIS-Mäusen
- Maushaltung von BALB/c -Rag2null Il2RγCnull SirpαNOD (BRGS) Mäusen
Anmerkung: Dieser Stamm ist extrem immundefizient und enthält keine T-, B- oder natürlichen Killerzellen (NK). Daher müssen rigorose Maßnahmen ergriffen werden, um opportunistische Infektionen zu verhindern. Halten Sie die Kolonie auf einer Diät, die Trimethoprim und Sulfadiazin enthält, in einem abwechselnden 2-wöchigen Schema mit einer normalen Ernährung. Halten Sie den Raum so vorsichtshalber wie möglich aufrecht (z. B. eine barrierefreie Duscheinrichtung mit eingeschränktem Zugang).
- Haltung von Kolonien von BALB/c -Rag2null Il2RγCnull SirpαNOD (BRGS) und BALB/c Rag2null Il2RγCnull SirpaBalb/c (BRG) homozygoten Mäusen als Züchter.
- Züchten Sie BRGSN/N×BRGB/B, umBRGS B/N-Welpen zu erzeugen, die als Empfänger menschlicher Stammzellen verwendet werden können. In dieser Kolonie sind BRGSB/N gesünder alsBRGS N/N und transplantieren in gleicher Menge (mehr als BRG).
- CD34+ Isolierung humaner Stammzellen aus Nabelschnurblut (CB)
Anmerkung: Bei diesem Verfahren werden keine Antibiotika verwendet. Daher ist eine gute sterile Technik unerlässlich.
- Legen Sie ein konisches Röhrchengestell mit 50 mL sowie 3x 15 mL und ~10x 50 mL konische Röhrchen in eine sterilisierte Biosicherheitswerkbank (BSC). Besprühen Sie einen Blutentnahmebeutel mit 70% Ethanol und lassen Sie ihn im BSC trocknen.
- Berechnen Sie die Anzahl der konischen 50-ml-Röhrchen, die für die Isolierung des CB-Dichtegradienten = CB-Volumen/15 erforderlich sind, aufgerundet und auf eine gerade Röhrchenzahl. Berechnen Sie das Blutvolumen pro Röhrchen = CB-Volumen/Anzahl der Röhrchen. Gießen Sie vorsichtig Blut aus dem CB-Beutel in jedes konische Röhrchen; dies sind maximal 15 mL pro Röhrchen. Verwenden Sie eine automatische Pipette und eine serologische 25-ml-Pipette, um das Blut 1:1 mit sterilem PBS zu mischen, indem Sie auf und ab pipettieren.
- Verwenden Sie eine automatische Pipette mit niedriger Geschwindigkeit und eine serologische 10-ml-Pipette, um das Blut langsam mit einer Dichtegradientenlösung bei Raumtemperatur (RT) von 1,077 g/ml (siehe Materialtabelle) zu unterlegen, ohne die Grenzfläche zu stören. Achten Sie darauf, dass die Pipettenspitze den Boden des Röhrchens nicht berührt. Wiederholen Sie den Vorgang für alle Tuben. Dann 30 min lang bei 850 x g ohne Bremsen bei RT zentrifugieren, um die Aufrechterhaltung des Dichtegradienten zu gewährleisten.
- Visualisieren Sie den zellulären Buffy-Mantel auf dem Dichtegradienten von 1,077 g/ml als trübe weiße Schicht. Entfernen und entsorgen Sie die Plasmaschicht bis zu einem Durchmesser von etwa 10 ml über dem Buffy Coat mit einer serologischen 25-ml-Pipette und einer automatischen Pipette.
- Sammeln Sie das Buffy Coat mit einer sterilen Transfer- oder serologischen Pipette. Kratzen Sie die Zellen mit der Pipette wie mit einem Spatel von der Seite des konischen Röhrchens ab, während Sie den Kolben loslassen (oder langsam pipettieren), um die Zellen nach oben zu ziehen. Kombinieren Sie die Buffy Coats aus zwei konischen 50-ml-Röhrchen zu einem neuen konischen 50-ml-Röhrchen.
- Waschen Sie die Zellen, indem Sie 45 ml sterile Hanks' ausgewogene Salzlösung (HBSS) mit 2 % fötalem Rinderserum (FBS) in jedes konische Röhrchen gießen. 11 min bei 360 x g bei RT zentrifugieren.
- Saugen Sie das Waschmedium in allen Rohren bis zum Pellet an. Verwenden Sie eine serologische 10-ml-Pipette und eine automatische Pipette, um das erste Pellet in 10 ml HBSS mit 2 % FBS zu resuspendieren. Resuspendieren Sie jedes Pellet in denselben 10 ml HBSS und spülen Sie jedes Röhrchen mit weiteren 10 ml HBSS, um alle Zellen in einem einzigen Röhrchen zu sammeln.
- Gießen Sie 45 ml steriles HBSS mit 2 % FBS in das konische Röhrchen. 10 min bei 360 x g, bei 4 °C zentrifugieren.
- Aspirieren Sie den Waschpuffer bis zum Zellpellet und resuspendieren Sie das Pellet in 20 mL magnetischem Zellseparatorpuffer (siehe Materialtabelle). Entfernen Sie ein kleines Aliquot, um die Zellen mit einem Hämazytometer in einer Verdünnung von 1:20 in Methylenblau zu zählen. Addieren Sie die Anzahl der blauen und weißen Zellen. Zentrifugieren bei 360 x g, 10 min bei 4 °C.
Anmerkung: Dieses Protokoll verwendet die Magnetbead-Technologie (siehe Materialtabelle). Das Protokoll kann für die Verwendung mit jeder Zelltrennungstechnologie modifiziert werden, bei ausreichender Reinheit und Ausbeute der CD34+-Stammzellen.
- Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie das aus Nabelschnurblut isolierte CD34+-Zellpellet in 300 μl magnetischem Zellseparatorpuffer pro 1 x 108 Zellen. Fügen Sie zuerst 100 μl Fc-Rezeptor (FcR)-Blockierungsreagenz und dann 100 μl CD34+ magnetische Kügelchen pro 1 x 108 Zellen hinzu. 30 min bei 4 °C (ohne Eis) inkubieren.
- Geben Sie 5 mL magnetischen Zellseparatorpuffer pro 1 x 108 Zellen hinzu und schleudern Sie bei 360 x g für 10 min bei 4 °C. Wiederholen Sie den Waschschritt und resuspendieren Sie das Pellet in 500 μl magnetischem Zellseparatorpuffer pro 1 x 108 Zellen in einem konischen 15-ml-Röhrchen mit der Bezeichnung "unfraktioniert".
- Beschriften Sie zwei weitere konische 15-ml-Röhrchen mit "CD34-" und "CD34+". Legen Sie die drei konischen 15-ml-Röhrchen (unfraktioniert, CD34- und CD34+) in die Schlitze A1, B1 bzw. C1 auf ein Kühlgitter (siehe Materialtabelle). Trennen Sie die Zellen mit dem zweispaltigen Positivauswahlprogramm auf einem automatischen magnetischen Zellseparator (siehe Materialtabelle) in einem BSC gemäß den Geräteanweisungen des Herstellers.
- Expansion und Einfrieren von CD34+ humanen Stammzellen
- Aliquotieren Sie 10 μl der zurückgewonnenen CD34+-Zellsuspension (2 ml) auf einem Hämozytometer-Objektträger und zählen Sie die Zellen unter 10-facher Vergrößerung. Berechnen Sie die Gesamtzahl der CD34+-Zellen, indem Sie die Zellzahl mit 2 x 104 multiplizieren. Teilen Sie die Gesamtzahl der CD34+-Zellen durch 250.000, um die Anzahl der einzufrierenden Fläschchen zu berechnen (50.000 Zellen pro Maus-Welpen vor der In-vitro-Expansion).
- Bereiten Sie das 10%ige fötale Kälberserum (FCS) des CB-Mediums Iscove (plus 1 ml extra für Filterverlust) zu, ergänzt mit 40 ng/ml Stammzellfaktor, 20 ng/ml FMS-ähnlichem Tyrosinkinase-3-Liganden (Flt3L) und 10 ng/ml Interleukin-6 (IL-6) und passieren Sie einen 0,22-μm-Filter. Resuspendieren Sie die CD34+-Zellen bei 100.000 pro ml CB-Medium und inkubieren Sie bei 37 °C. An Tag 3 wird ein äquivalentes Volumen CB-Medium ohne Zytokine in den Kolben mit den Zellen und das CB-Medium mit den Zytokinen gegeben.
Anmerkung: Die Zugabe dieser Zytokine an das CB-Medium fördert das Überleben und die Expansion der CD34+-Zellen und verhindert gleichzeitig die Differenzierung.
- Ernten Sie die expandierten CD34+-Zellen an Tag 5. Pipettieren Sie die Zellsuspension auf und ab und sammeln Sie sie in einem konischen 50-ml-Röhrchen. Geben Sie so viel CB-Medium hinzu, dass der Boden des Kolbens bedeckt ist. Kratzen Sie mit einem Zellschaber den gesamten Boden des Kolbens ab. Sammeln Sie alle Medien in dasselbe 50-ml-Röhrchen und zentrifugieren Sie sie 11 Minuten lang bei 360 x g.
- Resuspendieren Sie die Zellen in 2 ml CB-Medium. Bewahren Sie den letzten Tropfen aus der Pipette zum Zählen in eine 96-Well-Platte auf. Verdünnen Sie die Zellen 1:1 in Trypanblau und geben Sie 10 μl in das Hämazytometer, dann zählen und mitteln: Zellen aus vier Quadranten. Berechnen Sie die Gesamtzahl der CD34+-Zellen, indem Sie die Zellzahl mit 4 x 104 multiplizieren, und notieren Sie die Lebensfähigkeit.
- Es wird n+1 ml Gefriermedium hergestellt, wobei n die in Schritt 1.3.1 berechnete Anzahl der Gefrierfläschchen ist. Bereiten Sie das Gefriermedium vor, indem Sie 10 % (v/v) Dimethylsulfoxid (DMSO) zu FBS hinzufügen und auf Eis legen. Beschriften Sie die Kryofläschchen mit CB#, CD34+ d5 und Datum.
- Schleudern Sie die CD34+ Zellen bei 360 x g für 10 min bei 4 °C herunter. Saugen Sie das Medium bis zum Pellet ab und resuspendieren Sie das Zellpellet in Gefriermedium. Aliquotieren Sie 1 ml Zellsuspension in jede Durchstechflasche und verteilen Sie den Rest gleichmäßig auf die Durchstechflaschen. Geben Sie die Fläschchen in einen auf 4 °C gekühlten Isopropanol-Gefrierschrank, stellen Sie sie bei -80 °C auf und überführen Sie sie zu flüssigem Stickstoff, um sie >90 Tage lang zu lagern.
- Bestrahlung von Mäusewelpen
- Sammeln Sie die BGSB/N-Welpen 1-3 Tage nach der Geburt in einer autoklavierten Plastikbox mit Polsterung. Geben Sie eine kleine Menge Einstreu zu den Welpen. Beschriften Sie die Schachtel mit der Käfignummer und der Anzahl der Jungen.
- Stellen Sie den Bestrahlungskörper (siehe Materialtabelle) auf eine Dosis von 300 rad ein. Setzen Sie die Schachtel mit den Welpen in den Bestrahlungskörper ein und setzen Sie sie 300 rad aus. Bringen Sie die Welpen zurück in ihren Käfig, legen Sie sie auf einen Haufen und decken Sie sie mit Einstreu ab.
- Pup-Injektionen und CD34+-Zellvorbereitung
- Beginnen Sie mit der Vorbereitung der CD34+-Zellen ~3 h nach der Bestrahlung. 10 mL CB-Medium in einem konischen 50-ml-Röhrchen erwärmen. Führen Sie alle Schritte in einem sterilen BSC durch.
- Entnehmen Sie ein Fläschchen mit in vitro expandierten und gefrorenen CD34+-Zellen für jeweils vier bis sechs Welpen zur Injektion. Tauen Sie schnell bei 55 °C auf, bis nur noch eine kleine Menge Eis sichtbar ist, und geben Sie die Zellen in das erwärmte CB-Medium (das Fläschchen sollte sich noch kühl anfühlen). Verwenden Sie 1 ml Medium, um jedes Fläschchen zu spülen, und drehen Sie die Zellen 12 Minuten lang bei 4 °C bei 360 x g.
HINWEIS: Es wurde festgestellt, dass ein schnelles Auftauen bei 55 °C zu einer besseren Zellviabilität (90 %-95 %) führt als ein Auftauen bei 37 °C.
- Saugen Sie das Medium vorsichtig an. Resuspendieren Sie das (kleine) Pellet in 2 mL CB-Medien, mischen Sie vorsichtig und geben Sie ~30 μl der Zellsuspension in eine einzelne Vertiefung in einer Zählplatte. Verdünnen Sie 1:1 in Trypanblau, geben Sie dann 10 μl in ein Hämozytometer und zählen und mitteln Sie die Zellen aus vier Quadranten.
- Berechnen Sie die Gesamtzahl der CD34+-Zellen, indem Sie die Zellzahl mit 4 x 104 multiplizieren und dann die Lebensfähigkeit aufzeichnen. Bei 360 x g für 12 min bei 4 °C schleudern.
- Aspirieren Sie das Medium vorsichtig und resuspendieren Sie das Zellpellet in 100 μl sterilem PBS pro n+1 Welpen zur Injektion, was zu 250.000-450.000 CD34+ Zellen pro Maus führt. Legen Sie das konische Röhrchen auf Eis in einen Transportbehälter und begeben Sie sich zur Injektion der Welpen zum Vivarium.
- Bringen Sie eine Wärmelampe, Windeln, 1 mL Spritze, 18 g Nadel, 30 g Nadel und das CD34+ Zellpräparat in sterilen Behältern zum Vivarium BSC. Legen Sie eine sterile Windel ~2 Fuß unter die Wärmelampe. Holen Sie den Käfig mit der zu injizierenden Einstreu zurück und legen Sie ihn in die BSC.
- Montieren Sie die Spritze mit einer abgeschrägten 18-G-Nadel. Passen Sie den Winkel des konischen Rohrs an die Fase der Nadel an, mischen Sie die Zellsuspension vorsichtig und ziehen Sie sie auf. Legen Sie die Welpen zum Aufwärmen auf die Windel (achten Sie auf Überhitzung). Entfernen Sie die Luft aus der Spritze, ersetzen Sie die 18-G-Nadel durch die 30-G-Nadel und schieben Sie dann vorsichtig auf die Spritze, bis sich die Zellsuspension gerade an der Nadelspitze befindet.
Anmerkung: Alternativ kann auch eine Insulinspritze verwendet werden.
- Bringen Sie einen Welpen nach dem anderen an den Rand der Windel, weg von der Wärmelampe. Fixieren Sie den Welpen auf der Seite unter Daumen und Zeigefinger, um eine klare Sicht auf das Gesicht zu ermöglichen. Achte auf die Vene quer über der Wange, unter der Stelle, an der sich das Ohr befinden wird. Führen Sie die Nadel flach in die Vene (IV) ein, die dem Auge am nächsten liegt, und injizieren Sie langsam 50 μl Zellen.
- Prüfen Sie, ob sich bei einer subkutanen Injektion eine Blase bildet. Wenn ja, stechen Sie die Nadel tiefer ein und fahren Sie mit der Injektion von Zellen fort. Ein kleiner Tropfen Blut/Hämatom wird sichtbar sein, wenn dies erfolgreich ist.
- Wenn der Welpe noch immobilisiert ist, führen Sie eine intrahepatische Injektion (IH) mit weiteren 50 μl Zellen durch (insgesamt 100 μl pro Welpen von IV+IH). Die Leber kann als dunkler Fleck zwischen dem weißen Milchband und dem Brustkorb dargestellt werden. Legen Sie den injizierten Welpen auf eine Windel, die weiter von den nicht injizierten Welpen entfernt ist, und erhitzen Sie ihn.
Anmerkung: Die intravenöse Injektion führt zu einem besseren langfristigen Chimärismus als die IH-Injektion allein, aber die intravenöse Injektion ist nicht immer erfolgreich. Daher gewährleistet die Aufteilung der Injektion zwischen IV und IH die Transplantation in einen größeren Prozentsatz der Mäuse.
- Wiederholen Sie sowohl die Gesichtsvenen- als auch die IH-Injektionen für alle Welpen. Reinigen Sie jegliches Blut, setzen Sie die Welpen in ihrem Käfig in das Nest zurück und decken Sie es mit Einstreu ab.
