Eine adjuvante Therapie im Mausmodell mit einem unvollständig resezierten subkutanen Tumor

Zusammenfassung

Quelle: Rwandamuriye, F. X. et al., Ein Mausmodell eines unvollständig resezierten Weichteilsarkoms zum Testen von (neo)adjuvanten Therapien.J. Vis. Exp.(2020)

Dieses Video zeigt das Testen einer adjuvanten oder zusätzlichen Therapie in einem Mausmodell mit unvollständig resezierten subkutanen Tumoren. Die teilweise tumorresezierte Maus wird mit einem Antikörper behandelt, der auf das antizytotoxische Protein der T-regulatorischen Zellen abzielt, was möglicherweise das Nachwachsen des Tumors reduziert und auf eine wirksame adjuvante Therapie hindeutet.

Protokoll

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

1. Beimpfung von Zellen

1. Präparation von Zellen und Tieren
   1. Stellen Sie sicher, dass die Zelllinie in den empfohlenen Medien aufbewahrt wird. Bewahren Sie beispielsweise die WEHI 164-Zelllinie in einem Medium 1640 des Roswell Park Memorial Institute (RPMI) auf, das mit 2 mM L-Glutamin, 10 % fötalem Rinderserum, 20 mM 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethensulfonsäure (HEPES), 0,05 mM 2-Mercaptoethanol, 100 μg/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin.
      Anmerkung: Passagezellen mindestens 3 und bis zu 5 Mal nach der Entnahme aus der kryogenen Lagerung. Um eine optimale Zellviabilität zu gewährleisten, sollten Zellen gespalten werden, wenn sie zwischen 70 und 80 % konfluiert sind. Tumorzelllinien sollten auf Mykoplasmen getestet werden, da eine Infektion das Zellwachstum verändern und die Immunantwort in vivo beeinflussen kann.
   2. Einen Tag vor der Inokulation die Mäuse an der unteren rechten Flanke mit einer Schermaschine rasieren.
      Anmerkung: In diesem Experiment wurden weibliche BALB/c-Mäuse im Alter zwischen 8 und 12 Wochen mit normalem Gewicht (16 bis 22 Gramm) verwendet.
   3. Am Tag der Inokulation werden WEHI 164-Zellen geerntet, wenn 70-80% durch Trypsinisierung konfluiert sind.
      1. Aspirieren Sie das Nährmedium aus den Gewebekulturflaschen und fügen Sie dann eine sterile phosphatgepufferte Lösung (1x PBS) hinzu, um verbleibende Spuren von fötalem Rinderserum (FBS) zu entfernen.
      2. Das PBS wird aus den Gewebekulturflaschen aspiriert. Fügen Sie 3 ml 0,05 % Trypsin hinzu (für einen T75-Kolben) und schwenken Sie dann den Kolben so, dass die gesamte Oberfläche des Kolbens mit den Zellen von Trypsin bedeckt ist.
      3. Der Kolben wird 3 Minuten lang bei 37 °C und 5 % CO₂ -Inkubator inkubiert. Die Zellen werden regelmäßig durch Klopfen an den Seiten des Kolbens überprüft, um festzustellen, ob sich die Zellen gelöst haben.
      4. Nehmen Sie die Kolben aus dem Zellkultur-Inkubator und fügen Sie 5 ml Medium hinzu, das mit FBS angereichert ist, um das Trypsin zu neutralisieren.
         Anmerkung: Lassen Sie die Zellen nicht länger als nötig im Trypsin, da dies die Zellen schädigen und zu einer geringen Lebensfähigkeit der Zellen führen kann.
      5. Pipettieren Sie die Suspension mehrmals, um eine Einzelzellsuspension zu erhalten. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein konisches Zentrifugenröhrchen.
      6. Pelletzellen durch Schleudern bei 350 x g für 3 min.
   4. Waschen Sie die Zellen dreimal in 1x PBS.
      1. Resuspendieren Sie Zellen in 50 mL sterilem 1x PBS und waschen Sie die Zellen durch Auf- und Abpipettieren der Zellsuspension. Pelletzellen durch Schleudern bei 350 x g für 3 min.
      2. Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 15 ml sterilem 1x PBS. Waschen Sie die Zellen durch Auf- und Abpipettieren der Zellsuspension. Pelletzellen durch Schleudern bei 350 x g für 3 min.
      3. Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in genau 10 ml sterilem 1x PBS. Die Zellen werden wie in Schritt 1.1.4.2 gewaschen und eine kleine Menge (ca. 100 μl) der Zellsuspension zur Zählung in ein Zentrifugenröhrchen gegeben. Pelletzellen durch Schleudern bei 350 x g für 3 min.
   5. Bestimmen Sie die Zellzahl mit der Trypanblau-Ausschlussmethode, indem Sie entweder ein Hämozytometer oder einen automatisierten Zellzähler verwenden. Resuspendieren Sie Zellen in sterilem 1x PBS in einer Konzentration von 5 x 10⁶ Zellen/ml. Halten Sie die Zellsuspension auf Eis.
      Anmerkung: Die Lebensfähigkeit der Tumorzellen sollte gleich oder über 80 % liegen, um ein reproduzierbares Tumorwachstum zu gewährleisten.
2. Subkutane Inokulation
   1. Mischen Sie die Zellsuspension gründlich und füllen Sie eine Spritze mit einer 26 G Nadel mit 100 μL Zellsuspension (5 x 10⁵ Zellen) in sterilem 1x PBS. Wiederholen Sie das Mischen der Zellen, bevor Sie die nächste Spritze laden.
      Anmerkung: Halten Sie die Zellen während des gesamten Eingriffs auf Eis, um die Lebensfähigkeit zu erhalten.
   2. Halten Sie die Maus entsprechend fest, um den Zugang zur unteren rechten Flanke zu gewährleisten. Impfen Sie die Maus subkutan auf die rasierte untere rechte Flanke.
      Anmerkung: Stellen Sie sicher, dass sich die Inokulation nicht im Bauchfell befindet, indem Sie die Nadel leicht anheben, die unter der Haut sichtbar sein sollte. Nach der Inokulation sollte sich unter der Haut ein blasenartiger Klumpen bilden.
   3. Überwachen Sie Mäuse, wie es die geltende Ethikzulassung vorschreibt, und führen Sie eine chirurgische Resektion durch, wenn die Tumore auf eine Größe von etwa 50 mm^{angewachsen sind 2}.

>2. Partielle chirurgische Resektion des Tumors

HINWEIS: Dieses Protokoll erfordert ZWEI Forscher; einen für chirurgische Eingriffe (SURGEON) und einen für die Mausüberwachung (ASSISTANT).

1. Einrichtung der Chirurgie
   1. Am Tag 12 nach der Inokulation, wenn die Tumoren eine Größe von etwa 50 mm^erreicht haben2, dosieren Sie Mäusen 30 Minuten vor der Operation 100 μl (0,1 mg/kg) Buprenorphin s.c. in den Nacken.
   2. Richten Sie den Operationsbereich mit einem Wärmekissen ein, das mit einem Bankkittel bedeckt ist, und richten Sie einen Nasenkonus für die Anästhesie ein. Sterilisieren Sie chirurgische Instrumente vor der Verwendung und zwischen jedem Tier mit einem Hitzeperlensterilisator, damit die Werkzeuge vor dem Gebrauch abkühlen können. Halten Sie die folgenden chirurgischen Geräte sauber und griffbereit: Chlorhexidin, Tupfer, Gaze, Augengel, zwei gebogene Pinzetten, Schere, Clip-Applikator, Clip-Entferner und Clip-Nachfüllungen (Abbildung 1A, 1B).
   3. Erwärmen Sie die Heizkammer auf 37 °C und richten Sie ein weiteres Wärmekissen für die Wiederherstellung ein (Abbildung 1C). Legen Sie die sterilisierten Werkzeuge auf eine sterile Oberfläche, z. B. autoklavierte Pads.
2. Anästhesie
   1. Legen Sie die Maus in die Induktionskammer und betäuben Sie die Maus mit 4 % Isofluran (4 % in 100 % Sauerstoff bei einer Flussrate von 1 l/min), bis sich die Atemfrequenz auf ca. 60 Atemzüge pro Minute (1 pro Sekunde) verlangsamt (dies dauert normalerweise <1 min).
      Anmerkung: Lassen Sie die Maus nicht zu lange in der Kammer, da dies zum Ersticken und Tod führen kann. Halten Sie jeweils nur eine Maus unter Narkose.
   2. Übertragen Sie die Maus auf das Wärmekissen auf dem Operationstisch, platzieren Sie die Maus mit der Nase im Nasenkonus und halten Sie den Narkosezustand mit 3-4 % Isofluran in 100 % Sauerstoff bei einer Flussrate von 0,5 l/min aufrecht. Überwachen Sie die Atemfrequenz, um sicherzustellen, dass die Narkosetiefe erhalten bleibt.
      Anmerkung: Der ASSISTENT muss die Atmung der Maus während der gesamten Operation überwachen, um sicherzustellen, dass das richtige Anästhesieniveau aufrechterhalten wird. Senken Sie die Anästhesiekonzentration, wenn die Atmung zu langsam wird, oder erhöhen Sie die Konzentration, wenn die Narkosetiefe zu gering ist. Wenn die Maus anfängt zu keuchen, nehmen Sie die Maus aus dem Nasenkegel, verringern Sie die Anästhesiekonzentration und warten Sie, bis sich die Atmung normalisiert hat, bevor Sie sie wieder auf den Nasenkegel setzen.
   3. Führen Sie einen "Pinch-Test" und einen "Hornhautreflextest" durch, um sicherzustellen, dass die Maus vor Beginn der Operation vollständig betäubt ist.
      Anmerkung: Die Bewegung eines Teils der Maus ist ein Hinweis darauf, dass die Maus nicht vollständig betäubt ist. Das Tier sollte sofort ein zusätzliches Anästhetikum erhalten, indem die Anästhesiekonzentration erhöht wird.
   4. Bedecken Sie die Augen der Maus mit einer kleinen Menge Augengel, um Augentrockenheit zu vermeiden.
3. Chirurgischer Eingriff
   1. Tupfen Sie den Operationsbereich 3 Mal mit alkoholischem Chlorhexidin ab. Machen Sie mit einer Pinzette und einer Schere einen 1 cm langen geraden Schnitt entlang der dorsalen Seite, 3 mm vom Tumor entfernt (Abbildung 2A, 2B).
      Anmerkung: Die Standardisierung des Schnitts auf 1 cm bei jeder Maus (mit einem Lineal) ermöglicht eine gleichmäßige Beurteilung der Wundheilung zwischen Mäusen. Die Lokalisierung des Schnitts 3 mm vom Tumor entfernt ermöglicht eine anschließende intratumorale adjuvante Therapie ohne Leckage aus der Wunde.
   2. Ziehen Sie mit einer Pinzette die Faszie und das Unterhautfettgewebe zwischen Tumor und Bauchfell ab. Der subkutane Tumor ist in der Regel an der Hautseite befestigt.
   3. Öffnen Sie die Wunde, indem Sie die Haut mit einer Pinzette vorsichtig auf der tumortragenden Seite halten und den Tumor so "invertieren", dass er von außen sichtbar ist (Abbildung 2C, 2D).
      Anmerkung: Der Abschnitt des Tumors, der entfernt werden soll, sollte der Öffnung am nächsten sein, um genügend Haut zum Verschließen der Wunde zu haben. Achten Sie darauf, dass Sie sich bei der Entfernung des Tumors nicht in die Haut schneiden.
   4. Schneiden Sie mit einer Schere die Tumorkapsel in zwei Hälften ab, um sie zu entfernen, beginnend an der Basis des Tumors, die der Öffnung am nächsten liegt.
   5. Für eine 50%ige Debulk-Operation schneiden Sie quer durch die Mitte des Tumors. Schöpfen Sie mit einer gebogenen Pinzette den zu entfernenden Teil des Tumors auf (50%); Sammeln Sie alle Überreste aus dem aufgeblähten Bereich.
   6. Für 75 % Debulk ist ein 50 % Tumor-Debulk durchzuführen, wie in Teil 2.3.5 oben. Schneiden Sie dann die restlichen 50 % des Tumors in zwei Hälften und schöpfen Sie 25 % des Tumors mit einer gebogenen Pinzette auf, wie oben beschrieben.
4. Verschluss der Operationsstelle
   1. Legen Sie den verbleibenden Tumor wieder unter die Haut und ziehen Sie mit einer Pinzette die Hautlappen zusammen und richten Sie die Haut entlang der Wunde aus.
   2. Halten Sie die Haut 5 mm vom Wundrand entfernt zusammen und verwenden Sie chirurgische Klammern, um die Wunde zu schließen, beginnend auf der Seite, die der Pinzette am nächsten liegt. Bringen Sie so viele Clips wie nötig an, um sicherzustellen, dass kein darunter liegendes Gewebe freigelegt wird. In der Regel werden drei bis vier Clips mit einem Abstand von 2 mm zwischen den Clips aufgebracht.
      Anmerkung: Wenn Clips nicht richtig angewendet sind, entfernen Sie sie mit einem Clip-Entferner und ersetzen Sie sie durch neue Clips.
5. Bergung von Mäusen
   1. Lassen Sie die Mäuse sich erholen, indem Sie sie in die warme (37 °C) Heizkammer legen.
   2. Stellen Sie den Käfig der Maus auf das Heizkissen. Überwachen Sie die Mäuse in der Heizkammer, bis sie sich von der Narkose erholt haben (wach und gehend), und setzen Sie die Mäuse dann wieder in den Käfig. Lassen Sie den Käfig weitere 10 Minuten auf dem Heizkissen, bis die Mäuse aktiver geworden sind.
   3. Geben Sie den Mäusen nasses und weiches Futter. Überwachen Sie die Mäuse 1 Stunde nach der Operation auf Genesung und stellen Sie sicher, dass die Clips an Ort und Stelle bleiben. Stellen Sie sicher, dass der Käfig halb auf/halb außerhalb des Wärmekissens ist, damit die Tiere die Temperatur selbst regulieren können, wenn sie unbeaufsichtigt sind.
   4. Dosieren Sie Mäusen 0,1 mg/kg Buprenorphin (100 μl subkutan im Nacken) 6-8 Stunden nach der Operation (am Ende des Tages). Überwachen Sie die Mäuse am frühen Morgen des folgenden Tages und dosieren Sie den Mäusen erneut 0,1 mg/kg Buprenorphin (100 μl subkutan im Nacken). Geben Sie bei Bedarf mehr Nassfutter.
   5. Überwachen Sie die Mäuse in den nächsten sieben Tagen täglich. Clips können nach sieben Tagen mit dem Clip-Entferner entfernt werden.
6. Adjuvante oder neoadjuvante Behandlung
   1. Behandeln Sie Mäuse perioperativ mit einer (neo)adjuvanten Therapie zu einem bestimmten Zeitpunkt, abhängig von der interessierenden Behandlung.
   2. Behandeln Sie Mäuse beispielsweise mit einer Dosis von 100 μg anti-CTLA-4 intraperitoneal (i.p.) am Tag 15 nach der Inokulation oder mit drei Dosen von 200 μg anti-PD-1 i.p. an den Tagen 15, 17 und 19 nach der Inokulation.

Ergebnisse

Abbildung 1: Repräsentative Bilder des Operationsaufbaus.(A) Ein vollständiges Bild des Operationsaufbaus, auf dem die chirurgischen Instrumente (in Schritt 2.1 aufgeführt) und das Anästhesiegerät zu sehen sind. (B) Ein Schnappschuss des Operationstisches, auf dem alle Materialien in Reichweite zu sehen sind. (C) Eine Heizkammer und ein Heizkissen...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
26 Gauge 0,5 mL Insulinspritze	Becton Dickinson, Australien	326769	nichts
2-Mercaptoethanol	Life Technologies Australia Pty Ltd	21985023	nichts
Maschine für Betäubungsmittelgas	Darvall Vet, Australien	Artikelnummer: 2848	nichts
Anti-CTLA-4	BioXcell, Vereinigte Staaten von Amerika	BE0164	nichts
Anti-PD-1	BioXcell, Vereinigte Staaten von Amerika	Nr. BP0273	nichts
Buprenorphinhydrochlorid-Injektion, 0,3 mg/ml	RB healthcare UK Limited, Großbritannien	Artikel-Nr.: 55175	Rezept bestellen
Chlorhexidin OP-Peeling 4%	Perigo Australia, Australien	CHL01449F(Peeling	nichts
Fötales Rinderserum	CellSera, Australien	AU-FBS-PG	nichts
Pinzette Fein 10,5 cm	Chirurgisches Haus, Westaustralien	CC74110	nichts
Pinzette Fein 12 cm gezahnt	Chirurgisches Haus, Westaustralien	CC74212	nichts
Zange Hals 14 cm	Chirurgisches Haus, Westaustralien	CD01114	nichts
Heizkammer	Datesand Ltd, Großbritannien	Mini-Thermacage	nichts
HEPES (1M)	Life Technologies Australia Pty Ltd	15630080	nichts
Isofluran	Henry Schein Animal Health, Australien	Artikelnummer: 29405	Rezept bestellen
Gleitende Augensalbe	Alcon	n/a	nichts
Penicillin/Streptomycin 1000X	Life Technologies Australia Pty Ltd	15140122	nichts
Phosphat gepufferte Lösung 10x	Life Technologies Australia Pty Ltd	Artikel-Nr.: 70013-032	nichts
Reflex 7mm Clips	Able scientific, Australien	AS59038	nichts
Reflex 7mm Wund-Clip-Applikator	Able scientific, Australien	AS59036	nichts
Reflex Wundclip Entferner	Able scientific, Australien	AS59037	nichts
Nagetier Qube Anästhesie-Atemkreislauf	Darvall Vet, Australien	#7885	nichts
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium + L-Glutamin	Life Technologies Australia Pty Ltd	21870092	nichts
Schere Iris STR 11 cm	Chirurgisches Haus, Westaustralien	KF3211	nichts
Schere Iris STR 9 cm	Chirurgisches Haus, Westaustralien	JH4209	nichts
Kleine Induktionskammer	Darvall Vet, Australien	Artikelnummer: 9630	nichts
TrypLE express 1x	Life Technologies Australia Pty Ltd	Artikel-Nr.: 12604-021	nichts