Eine Technik zur Transplantation menschlicher Haut in einem Mausmodell

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

>1. Verarbeitung einer menschlichen Spenderhautprobe

HINWEIS: Die menschliche Hautprobe, die für diese Transplantation verwendet wurde, war eine große Probe, die aus dem Bauch eines gesunden Patienten entnommen wurde. Die Probe muss mindestens 15 cm x 7,5 cm groß sein. Größenbeschränkungen können sich auf die Anzahl der Mäuse auswirken, für die Haut zur Verfügung steht, und auf die Wahl der Transplantatgröße.

1. Bewahren Sie die Hautprobe vor der Aufbereitung und Transplantation bei kalten Temperaturen (auf Eis; 4 °C) auf. Halten Sie die Probe in einem geschlossenen Probenentnahmebecher feucht, wobei die Gaze in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) getränkt ist.
   HINWEIS: Es wird nicht empfohlen, die Hautprobe länger als 2 Tage bei 4 °C zu lagern. Es gibt jedoch Berichte, bei denen die Hautproben länger gelagert werden.
   Vorsicht: Behandeln Sie sämtliches menschliches Gewebe mit den üblichen Vorsichtsmaßnahmen gegen biologische Gefahren.
2. Bereiten Sie die Dermatomierung der menschlichen Hautprobe in einer sterilisierten Unterdruck-Gewebekulturhaube auf einem sterilisierten Präparierbrett vor.
3. Legen Sie die Hautprobe mit der Epidermisseite nach oben auf das Sezierbrett. Wischen Sie die Epidermis mit einem sterilen Alkohol-Vorbereitungspad und dann mit PBS ab.
4. Stecken Sie die engere Kante der Haut mit einem 1,5-Zoll-Präparier-T-Stift fest (siehe Materialtabelle).
5. Dermatomieren Sie die Hautprobe mit einer Dicke von 400 μm und üben Sie gleichmäßigen Druck aus, während Sie in einem Winkel von 30°-45° nach vorne schneiden. Befolgen Sie alle gerätespezifischen Anweisungen und Sicherheitsmaßnahmen (siehe Materialtabelle).
   HINWEIS: Einzelheiten zur Dermatomtechnik finden Sie in einem zuvor veröffentlichten Bericht.
6. Bereiten Sie eine 100 mm x 20 mm große Petrischale vor, indem Sie eine sterile, in sterilem PBS getränkte Gaze auf den Boden der Schale legen. Legen Sie die Haut mit der Epidermisseite nach oben auf die feuchte Gaze.
7. Versiegeln Sie die Plattenränder und decken Sie sie mit einer halbtransparenten Siegelfolie ab (siehe Materialtabelle), um sicherzustellen, dass die Probe nicht verunreinigt wird. Lagern Sie die Probe vor der Transplantation bei 4° C.

>2. Konditionierung und Vorbereitung vor der Operation

1. Bereiten Sie die sterilen Instrumente und eine sterile Operationsstation für die Transplantation vor. Verwenden Sie autoklavierte Papiertücher als sterile Oberflächen für die Platzierung von Instrumenten und Mäusen.
   HINWEIS: Mäuse können nach dem Absetzen transplantiert werden, werden aber vorzugsweise im Alter von 8-10 Wochen verpflanzt. Mäuse beiderlei Geschlechts können transplantiert werden.
2. Führen Sie die chirurgische Vorbereitung, wie z. B. die Haarentfernung, in einem Bereich durch, der physisch von der Operationsstation getrennt ist.
3. Bereiten Sie das Anti-GR1 (siehe Materialtabelle) vor, indem Sie es in steriler Kochsalzlösung auf 1 mg/ml verdünnen. Dosieren Sie jeder Maus nach der Anästhesieeinleitung intraperitoneal 100 μg/100 μl der Anti-GR1-Lösung.
4. Betäuben Sie die Mäuse nacheinander mit Isofluran oder anderen institutionell zugelassenen Anästhetika.
   HINWEIS: Isofluran muss während der Induktion in einer Konzentration von 3 % bis 5 % verabreicht werden. Sobald die Maus unbeweglich ist, senken Sie die Isoflurankonzentration auf 1 % bis 3 %, um die Dauer der Operation zu beeinflussen.
   1. Überwachen Sie die Maus auf eine angemessene Anästhesietiefe, indem Sie die Atemfrequenz, das Fehlen einer Zehenklemmreaktion und eine angemessene rosa Färbung von Ohren und Mund beobachten.
      Vorsicht: Verwenden Sie geeignete Anästhesiegeräte und Spülmethoden und vermeiden Sie den Kontakt mit Isoflurandämpfen.
5. Übertragen Sie die Maus auf ein Heizkissen oder eine andere Wärmequelle (siehe Materialtabelle).
6. Verabreichen Sie die Augensalbe, indem Sie mit einem behandschuhten Finger einen kleinen Tropfen Salbe auf das Auge tupfen.
Die
7. Analgetika Buprenorphin (0,08 mg/kg) und Carprofen (5 mg/kg) (siehe Materialtabelle) subkutan verabreichen, indem die Haut eingeklemmt und in einem Winkel parallel zum Körper injiziert wird.
   HINWEIS: Bereiten Sie die Analgesie vor der Behandlung gemäß den institutionellen Protokollen vor. Befolgen Sie die institutionellen Richtlinien für die Auswahl und Verabreichung von Analgetika. Die in dieser Studie verwendete Analgesiemethode ist in Schritt 2.7 und Abbildung 1 beschrieben.
8. Verabreichen Sie das Anti-GR1 (hergestellt in Schritt 2.4) intraperitoneal, indem Sie die Maus leicht am Schwanz anheben, den Bauch freilegen und in einem Winkel von 30° mit einer Insulinspritze von 1 ml (12,7 mm) injizieren.
9. Verwenden Sie eine tierversuchsfreie elektrische Schermaschine (siehe Materialtabelle), um den mittleren und oberen Teil der Rückenseite der Maus zu rasieren.
10. Säubern Sie alle Haare und tragen Sie eine großzügige Menge Haarentfernungssalbe für 30 s bis 1 min auf die rasierte Haut auf.
11. Wischen Sie die Haarentfernungssalbe mit einem Papiertuch und PBS vollständig ab.

>3. Ablauf der Transplantation

1. Bringen Sie die Maus an eine sekundäre chirurgische Stelle, weg von der Haarentfernungsstation.
2. Sterilisieren Sie die Operationsstelle mit dem Jodstäbchen in kreisenden Bewegungen, beginnend in der Mitte und zum Rand des enthaartenden Bereichs hin.
3. Legen Sie ein Stück sterile Plastikfolie über die Maus und schneiden Sie ein Fenster in das Plastik, das etwas größer ist als die Größe der zu transplantierenden Fläche.
4. Schneiden Sie mit einem Skalpell einen rechteckigen 10 mm x 10 mm großen Teil der Spenderhaut ab, der transplantiert werden soll. Halten Sie dazu die Spenderhaut mit der Rückseite der Pinzette fest an Ort und Stelle und schneiden Sie mit dem Skalpell neben der Pinzette.
5. Schneiden Sie mit der chirurgischen Schere eine rechteckige Fläche der Maushaut ab, die der Größe des Spenderhautstücks entspricht, und erstellen Sie ein Transplantatbett. Ziehe die Haut mit einer Pinzette vom Körper weg und schneide die Haut mit der Schere vom Körper weg, um zu vermeiden, dass sie tief in die Gesichtsbehandlung einschneidet.
6. Legen Sie das Spenderhautstück mit der Epidermisseite nach oben auf das vorbereitete Transplantatbett.
7. Manipulieren Sie die Haut mit der Rückseite der Pinzette hin und her, bis die Spenderhaut vollständig flach auf dem Transplantatbett anliegt.
8. Geben Sie Tropfen chirurgischen Kleber (siehe Materialtabelle) an die Stelle, an der die Spenderhaut auf die Maushaut trifft, und halten Sie die Maus- und Spenderhaut mit einer Pinzette 1-2 s lang zusammen, damit der Kleber am Gewebe haftet. Versiegeln Sie den Rand des Transplantats vollständig und lassen Sie den Kleber vollständig trocknen.
9. Verbinden Sie die Mäuse (Abbildung 2) mit den folgenden Schritten.
   1. Schneiden Sie ein Stück Vaselinegaze (siehe Materialtabelle) groß genug, um den Transplantatbereich vollständig zu bedecken.
   2. Decken Sie das Transplantat mit der Vaselinegaze ab und drücken Sie die Gaze mit einer Pinzette leicht gegen die Haut.
   3. Schneiden Sie einen Streifen eines transparenten Folienverbandes der Länge nach so ab, dass die Breite groß genug ist, um die Wunde der Maus zu bedecken.
   4. Drücken Sie den transparenten Folienverband mit der Klebeseite nach unten fest über die Gaze. Rollen Sie die Maus schnell, um den Verband vollständig um den Oberkörper zu wickeln, um sicherzustellen, dass er fest sitzt, ohne die Atmung zu behindern, und dass alle Gliedmaßen frei beweglich sind.
   5. Legen Sie die Maus in einen Wiederherstellungskäfig und überwachen Sie sie, bis sie wach ist und sich bewegt. Stellen Sie nach der Wiederherstellung mindestens 15 Minuten lang eine Wärmequelle auf einem Teil des Käfigs bereit.
      HINWEIS: Es wird erwartet, dass sich die Tiere innerhalb von 1-5 Minuten nach dem Einsetzen in den Auffangkäfig erholen.

Abbildung 1: Zeitleiste des Protokolls, das für die Xenotransplantat-Studie angenommen wurde.

Abbildung 2: Methode zum Verbinden der Maus nach der Operation. Die Maus wird unter Narkose fest in Vaselinegaze und einen transparenten Filmverband gewickelt. (A) Vaselinegaze wird auf eine Fläche gelegt, die etwas größer als die Operationswunde ist. (B) Der transparente Filmverband wird vorbereitet: Ein langer Streifen wird etwas breiter als die Vaselinegaze geschnitten. Die Unterlage, die die Klebeseite des transparenten Folienverbandes abdeckt, wird teilweise entfernt. (C) Die Klebeseite der Folie wird fest gegen die Rückseite der Maus gedrückt, so dass am vorderen Ende der Folie ein Zoll Platz bleibt. (D) Die Maus ist auf den Rücken gedreht. Der überhängende vordere Teil der Folie wird auf die Maus gedrückt und die Rückseite entfernt. (E) Die Maus wird fest in die Folie eingewickelt, und die verbleibende Stütze wird entfernt, wenn die Maus eingewickelt wird. (F) Die Maus ist erfolgreich in den Verband eingewickelt und ihre Arme und Beine sind frei.