Alle Verfahren, die die Probenentnahme beinhalten, wurden in Übereinstimmung mit den IRB-Richtlinien des Instituts durchgeführt. Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom örtlichen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. Etablierung eines PBMC-basierten Modells für den Menschen
- Myeloablation von NOD/SCID-Mäusen mit Cyclophosphamid: Bestimmung der optimalen Dosen
- Kaufen Sie weibliche nicht-adipöse Diabetiker-/schwere kombinierte Immundefizienz-Mäuse (NOD/SCID) (6-8 Wochen).
Anmerkung: Alle Mäuse, die an dieser Studie beteiligt waren, waren weiblich.
- Cyclophosphamid (CP) in unterschiedlichen Dosen (50, 100 und 150 mg/kg) in Kochsalzlösung herstellen. Bereiten Sie Disulfiram (DS) in 0,8 % Tween-80 in Kochsalzlösung in einer Menge von 125 mg/kg
HINWEIS: Es wurden unterschiedliche CP-Konzentrationen hergestellt, um die Verabreichung gleicher Mengen der Arzneimittellösung an Mäuse zu ermöglichen, die unterschiedliche CP-Dosen erhielten.
- Behandeln Sie die Tiere 2 Tage lang einmal täglich mit CP (intraperitoneal, i.p.) und DS (peroral, p.o.). Geben Sie DS (p.o.) 2 h nach jeder Dosis von CP.
HINWEIS: DS verringert die Urotoxizität von CP bei Mäusen, und es wurde vermutet, dass CP in Kombination mit DS eine länger anhaltende Neutropenie aufweist als Tiere, die nur mit CP behandelt wurden. Das Dosierungsschema von CP muss möglicherweise vor tatsächlichen Studien vorab festgelegt werden und es wurde festgestellt, dass es zwischen verschiedenen immundefizienten Mausstämmen leicht variiert.
- Entnehmen Sie Blutproben aus dem Venensinus orbitalis und geben Sie sie an Tag 0 (1 h vor der 1. Dosis), Tag 2 (24 h nach der 2. Dosis) und Tag 4 (72 h nach der 2. Dosis) in mit Kaliumethylendiamintetraessigsäure (EDTA-K) beschichtete Röhrchen auf Eis.
- Untersuchen Sie den Myeloablationseffekt nach CP- und DS-Behandlung durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS). Verwenden Sie das Ratten-Anti-Maus-CD11b (M1/70), das Ratten-Anti-Maus-Ly6C (HK1.4) und das Ratten-Anti-Maus-Ly6G (1A8) zum Gating von CD11b+Ly6Choch als Neutrophile, CD11b+Ly6Choch als Monozyten.
- Erfassen Sie das Körpergewicht und den Gesundheitszustand der Mäuse täglich für eine Woche. Die optimale Dosis von CP und DS wird als das Schema bestimmt, das zu einer maximalen Depletion von Neutrophilen und Monozyten führt, ohne eine schwere Toxizität für Mäuse zu verursachen.
- Humane PBMC-Transplantation und Tumortransplantation: Modellaufbau
- Isolierung humaner PBMCs von gesunden Spendern durch Dichtegradientenzentrifugation gemäß den Anweisungen des Herstellers.
- Die Mäuse werden mit CP und DS vorbehandelt, wie in den Schritten 1.1.2 und 1.1.3 beschrieben, um die Transplantationseffizienz zu erhöhen.
- 20 bis 24 h nach der zweiten Dosis von CP und DS humane Tumorzelllinien wie A431-Zellen (ATCC, 2,5 x 106) und 5 x 106 isolierte PBMCs (gemischt mit insgesamt 200 μL phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) mit 50% Matrigel) oder Tumorfragmente (3 x 3 x 3 mm3, in einem Gesamtvolumen von 200 μL PBS mit 50 % Matrigel) und 200 μL von 5 x 106 PBMCs (je 100 μL links und rechts des transplantierten Tumorfragments) subkutan (s.c.) in der rechten Flanke der Tiere.
- Messen Sie das Volumen des Primärtumors und zeichnen Sie 4-6 Wochen lang zweimal pro Woche auf.
Anmerkung: Die Mäuse werden eingeschläfert, sobald ihr Körpergewicht um mehr als 20 % abnimmt oder ihr Tumorvolumen 2.000 mm3 erreicht oder der Tumor ulzeriert ist.
Die - Mäuse werden in Gaskammern mit Kohlendioxid eingeschläfert. Sammeln Sie das gesamte Tumorgewebe von geopferten Mäusen mit einer Augenschere und bereiten Sie es für die histologische und immunhistochemische (IHC) Analyse auf. Untersuchen Sie die humanen CD8-, PD-1- und PD-L1-Expressionen in diesen Geweben.
