siRNA-basierte Hemmung der Autophagie in Herpes-simplex-Virus-infizierten unreifen dendritischen Zellen

Zusammenfassung

Quelle: Düthorn, A., et al. siRNA-Elektroporation zur Modulation der Autophagie in dendritischen Zellen mit Herpes-simplex-Virus Typ 1-infizierten Monozyten-abgeleiteten Zellen. J. Vis. Exp. (2019).

Dieses Video zeigt eine auf kleiner interferierender RNA (siRNA) basierende Technik, um den autophagischen Fluss zu stören. Eine siRNA, die auf FIP200-mRNA abzielt, wird mittels Elektroporation in von Monozyten abgeleitete unreife dendritische Zellen (iDCs) eingeführt, was zu einem Knockdown der FIP200-Expression und zur Hemmung der nuklearen Laminstörung durch Autophagie führt. Bei Zugabe des Herpes-simplex-Virus (HSV) wird der Kernaustritt der viralen Nachkommen gehemmt, da keine Laminstörung durch autophagischen Fluss stattfindet.

Protokoll

Monozyten-abgeleitete DCs wurden aus Leukaphereseprodukten gesunder Spender generiert. Hierfür wurde ein positives Votum der lokalen Ethikkommission eingeholt (Referenznummer 4556). Die Experimente der vorliegenden Studie wurden in Übereinstimmung mit den Empfehlungen der Ethikkommission der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg (Referenznummer 4556) durchgeführt. Alle Spender stimmten einer schriftlichen Einverständniserklärung zu, einschließlich der Übereinstimmung mit der Erklärung von Helsinki.

>1. Erzeugung und Handhabung von unreifen dendritischen Zellen (iDCs) und reifen dendritischen Zellen (mDCs)

1. Isolieren Sie humane mononukleäre Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) aus Leukoreduktionssystemkammern (LRSCs), wie zuvor beschrieben. Vermeiden Sie die Kryokonservierung von PBMCs und verwenden Sie sie direkt nach der Isolierung, um höhere DC-Erträge zu erzielen.
2. Erzeugen Sie humane DCs aus PBMCs verschiedener gesunder Spender in T175-Zellkulturflaschen, wie zuvor beschrieben. Kurz gesagt, verwenden Sie 350-400 Millionen PBMCs in 30 ml DC-Medium (RPMI 1640 ohne L-Glutamin, 1 % (v/v) Humanserum Typ AB (AB-Serum), 100 U/mL Penicillin, 100 mg/ml Streptomycin, 0,4 mM L-Glutamin, 10 mM 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazineethansulfonsäure (HEPES)) pro Zellkulturflasche zur Isolierung von Monozyten durch Adhärenz. Nach 1 h die nicht anhaftende Fraktion mit RPMI 1640 abwaschen. Fügen Sie frisches DC-Medium hinzu, das mit 800 U/ml Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierendem Faktor (GM-CSF) und 250 U/ml Interleukin-4 (IL-4) ergänzt wird, und inkubieren Sie es 3 Tage lang.
   1. An Tag 3 nach der Adhärenz 5 ml frisches DC-Medium mit GM-CSF und IL-4 mit einer Endkonzentration von 400 U/ml bzw. 250 U/ml pro Zellkulturkolben zur DC-Differenzierung hinzufügen.
   2. Um iDCs zu gewinnen, spülen Sie lose haftende iDCs am Tag 4 nach der Adhärenz vorsichtig vom Boden des Zellkulturkolbens ab. Wiederholen Sie diesen Schritt 2 Mal. Zur Erzeugung von mDC wird ein Reifungscocktail hinzugefügt, der sich wie folgt zusammensetzt: GM-CSF (Endkonzentration: 40 U/ml), IL-4 (Endkonzentration: 250 U/ml), Interleukin-6 (IL-6, Endkonzentration: 1000 U/ml), Interleukin-1 beta (IL-1β, Endkonzentration: 200 U/ml), Tumornekrosefaktor alpha (TNF-α, Endkonzentration: 10 ng/ml), Prostaglandin E2 (PGE2; Endkonzentration: 1 μg/ml).
   3. Sechs Tage nach der Adhärenz (zwei Tage nach Induktion der Reifung mit einem Zytokincocktail) spülen Sie die mDCs vom Boden des Zellkulturkolbens aus. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal.
      Anmerkung: Unreife und reife DCs können nacheinander von identischen Spendern in 1 Zellkulturflasche erzeugt werden. Zu diesem Zweck wird i) die entsprechende Anzahl von iDCs getrennt und ii) die Reifung der verbleibenden Zellen in den Kolben unter Verwendung des in Schritt 1.2.2 aufgeführten Zytokincocktails induziert.
3. Überführen Sie iDCs oder mDCs im jeweiligen Zellkulturmedium in 50 mL Röhrchen. Ernten Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 300 x g für 5 min.
   1. DCs in 5-10 mL RPMI 1640 pro Zellkulturflasche vorsichtig resuspendieren (= waschen). Kombinieren Sie die jeweiligen DC-Aufhängungen in einer Röhre.
   2. Definieren Sie die Zellnummer mit einer Zählkammer oder einer alternativen Methode. Vermeiden Sie Temperaturschwankungen beim Umgang mit iDCs, um das Risiko phänotypischer Veränderungen zu verringern.

2. Durchflusszytometrische Analysen zur Überwachung des phänotypischen Reifungsstatus

1. Übertragen Sie iDCs oder mDCs (0,5 x 10⁶) aus Schritt 1.3.1 in ein 1,5 mL-Röhrchen. Ernten Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 3390 x g für 1,5 min. Waschen Sie die Zellen einmal mit FACS-Puffer (PBS ergänzt mit 2% fötalem Kälberserum (FCS)).
2. Resuspendieren Sie die Zellen in 100 μl Antikörper-Färbelösung (FACS-Puffer), die spezifische Fluorochrom-markierte Antikörper gegen definierte Oberflächenmoleküle enthält.
   1. Verwenden Sie die folgenden Antikörper, um die Reinheit (CD3-Fluorescein-Isothiocyanat [FITC], CD14-Phycoerythrin [PE]) sowie den Reifungsstatus von DCs (CD80-PacBlue [Pacific Blue]/-PE-Cyanin5 [Cy5], CD11c-PE-Cy5, CCR7-PE-Cy7, CD83-APC, CD86-PE, MHCII-APC-Cy7) zu überprüfen.
   2. Bereiten Sie eine ungefärbte Probe in 100 μl FACS-Puffer als Kontrolle vor.
   3. Färben Sie die Zellen 30 min lang im Dunkeln auf Eis.
3. Anschließend die Zellen zweimal in 1 mL FACS-Puffer waschen und 1,5 min bei 3390 x g zentrifugieren.
4. Zum Schluss resuspendieren Sie die Zellen in 200 μl FACS-Puffer, der mit 2 % Paraformaldehyd (PFA) ergänzt ist, und analysieren Sie die Zellen mittels Durchflusszytometrie. Fixierte Zellen können bei 4° C im Dunkeln bis zu 2 Tage gelagert werden.

>3. Interferenz des HSV-1-induzierten autophagischen Flusses durch Elektroporation von iDCs mittels FIP200-siRNA

HINWEIS: Das vorliegende Protokoll für die siRNA-Elektroporation wurde von Prechtel et al. (2007) und Gerer et al. (2017) modifiziert.

1. Übertragen Sie iDCs (12 x 10⁶) am Tag 3,5 nach der Adhärenz in ein 50-ml-Röhrchen. Anschließend werden die Zellen bei 300 x g für 5 min zentrifugiert und der Überstand verworfen. Führen Sie parallel dazu eine durchflusszytometrische Analyse durch, um den Reifungsstatus zu überwachen, wie in Schritt 2 beschrieben (Verwenden Sie Life/Dead Violet anstelle von CD80-PacBlue).
2. Waschen Sie iDCs vorsichtig in 5 mL OptiMEM ohne Phenolrot und zentrifugieren Sie die Zellen 5 Minuten lang bei 300 x g. Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die iDCs vorsichtig in 200 μl OptiMEM ohne Phenolrot, wobei Sie eine Zellkonzentration von 6 x 10⁶/100 μl einstellen. Legen Sie die Zellen nicht auf Eis und vermeiden Sie Temperaturschwankungen. Machen Sie schnell weiter und vermeiden Sie lange Inkubationszeiten von iDCs in OptiMEM ohne Phenolrot.
3. Entweder 75 pmol FIP200-spezifische siRNA oder 75 pmol gerührte siRNA als Kontrolle in 4 mm Elektroküvetten überführen und 100 μl (6x10⁶ Zellen) der Zellsuspension hinzufügen. Direkte Pulsung von iDCs mit dem Elektroporationsgerät I unter Anwendung der folgenden Einstellungen: 500 V für 1 ms.
   1. Vor dem experimentellen Verfahren siRNA-Suspensionen gemäß den Anweisungen des Herstellers herstellen, aliquotieren und bei -20 °C lagern. Auftauen und auf Eis halten, wenn diese siRNAs zur Elektroporation verwendet werden. Vor dem Elektroporieren der Proben ist ein Prüfimpuls durchzuführen.
4. Nach der Elektroporation iDC direkt in 6-Well-Platten mit frischem, vorgewärmtem Gleichstrommedium (ergänzt mit 40 U/ml GM-CSF und 250 U/ml IL-4) übertragen. Die Zellen werden in einer Endkonzentration von 1 x 10⁶/ml ausgesät und in einen Inkubator gegeben. Spülen Sie die Zellen nicht aus der Elektroküvette aus.
5. Nach 48 h wird zunächst die Morphologie der elektroporierten iDCs mikroskopisch untersucht. Ernten Sie dann die Zellen mit einem Zellschaber und überführen Sie sie in 15-ml-Röhrchen. Spülen Sie die Vertiefungen mit 1 mL PBS, ergänzt mit 0,01 % Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), und geben Sie die Lösung in die entsprechenden Röhrchen.
6. Teilen Sie anschließend 6 x 10⁶ iDCs pro siRNA-Bedingung auf, wie in den nächsten Schritten beschrieben.
   1. Verwenden Sie 0,5 x 10⁶ Zellen, um den Reifungsstatus und die Zellviabilität zu beurteilen, wie in Schritt 2 beschrieben. Verwenden Sie die folgenden Antikörper: CD11c-PE-Cy5, CCR7-PE-Cy7, CD83-APC, MHCII-APC-Cy7 und Life/Dead violet.
   2. Verwenden Sie 1 x 10⁶ Zellen für Western-Blot-Analysen, um die FIP200-spezifische Knockdown-Effizienz zu überprüfen. Übertragen und ernten Sie die Zellen in ein 1,5 mL Safelock-Röhrchen durch Zentrifugation bei 3390 x g für 1,5 min. Bereiten Sie Zelllysate vor und führen Sie Western-Blot-Analysen durch.
   3. Die restlichen Zellen (4,5 x 10⁶) werden für HSV-1-Infektionsexperimente verwendet. Für jede Versuchsbedingung werden 2,25 x 10⁶ iDCs in 2-ml-Röhrchen überführt und entweder mit HSV1 bei einer Multiplizität der Infektion (MOI) von 2 infiziert oder MNT-Puffer als Scheinkontrolle hinzugefügt. Führen Sie die Infektion wie beschrieben durch.
   4. 20 h nach der Infektion (hpi) ernten Sie die Zellen mit einem Zellschaber und bereiten Sie die Zelllysate für Western-Blot-Analysen vor.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
4D-Nukleofektor-Kerneinheit (Elektroporationsapparatur II)	Lonza (Basel, Schweiz)	AAF-1002B
AB-Serum	Sigma Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Deutschland)	Nr. H4522	Kultivierung dendritischer Zellen
ACD-A	Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Deutschland)	9007281
Amaxa P3 Primärzelle 4D-Nukleofector X Kit L (Elektroporationskit Gerät II)	Lonza (Basel, Schweiz)	V4XP-3024
Amersham ECL Prime Western Blotting-Detektionsreagenz	GE Healthcare (Solingen, Deutschland)	RPN2232	Western-Blot-Nachweis
Ammoniumpersulfat (APS)	Sigma Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Deutschland)	Nr. A3678
anti-maus-IgG (Maus, polyklonal, HRP)	Zellsignalisierung (Leiden, Niederlande)	7076	Western Blot-Nachweis
Anti-Kaninchen-IgG (Ziege, polyklonal, HRP)	Zellsignalisierung (Leiden, Niederlande)	7074	Western Blot-Nachweis
BD FACS Canto II Durchflusszytometer	BD Biosciences (Heidelberg, Deutschland)	338962
Blotting-Kammer Fastblot B44	Biometra (Göttingen, Deutschland)	Artikel-Nr.: 846-015-100
CCR7 (Maus, Pe-Cy7)	BioLegend (Fell, Deutschland)	557648	Durchflusszytometrie Verdünnung: 1:100 Klon: G043H7
CD11c (Maus, Pe-Cy5)	BD Biosciences (Heidelberg, Deutschland)	561692	Durchflusszytometrie Verdünnung: 1:100 Klon: B-ly6
CD14 (Maus, PE)	BD Biosciences (Heidelberg, Deutschland)	555398	Durchflusszytometrie Verdünnung: 1:100 Klon: M5E2
CD3 (Maus, FITC)	BD Biosciences (Heidelberg, Deutschland)	555332	Durchflusszytometrie Verdünnung: 1:100 Klon: UCHT1
CD80 (Maus, V450)	BD Biosciences (Heidelberg, Deutschland)	560442	Durchflusszytometrie Verdünnung: 1:100 Klon: L307.4
CD83 (Maus, APC)	eBioscience Thermo Fisher Scientific (Langenselbold, Deutschland)	Tel.: 17-0839-41	Durchflusszytometrie Verdünnung: 1:200 Klon: HB15e
CD86 (Maus, PE)	BD Biosciences (Heidelberg, Deutschland)	553692	Durchflusszytometrie Verdünnung: 1:100
EVOS FL Zell-Bildgebung	System AMG/Life Technologies (Carlsbad, USA)	AMF4300
FIP200 (Kaninchen)	Zellsignalisierung (Leiden, Niederlande)	Artikel-Nr.: 12436	Western-Blot-Erkennung Verdünnung: 1:1000 Klon: D10D11
Genpulser II-Apparatur (Elektroporationsapparatur I)	BioRad Laboratories GmbH (München, Deutschland)	Tel.: 165-2112
GM-CSF (4x104 U/ml)	Miltenyi Biotec (Bergisch Gladbach, Deutschland)	Tel.: 130-093-868
HLA-DR (Maus, APC-Cy7)	BioLegend (Fell, Deutschland)	307618	Durchflusszytometrie Verdünnung: 1:200 Klon: L243
HSV-1/17+/CMV-EGFP/UL43	BioVex		DC-Infektion
IL-1β (0,1 x 106 U/ml)	Cell Genix GmbH (Freiburg, Deutschland)	Tel.: 1411-050
IL-4 (1x106 U/ml)	Miltenyi Biotec (Bergisch Gladbach, Deutschland)	Tel.: 130-093-924
IL-6 (1x106 U/ml)	Cell Genix GmbH (Freiburg, Deutschland)	Tel.: 1404-050
ImageQuant LAS 4000	GE Healthcare (Solingen, Deutschland)	28955810
L-Glutamin	Lonza (Basel, Schweiz)	17-605E
LIVE/DEAD Fixierbares violettes Fleckenset für tote Zellen	Life Technologies (Carlsbad, CA, USA)	Nr. L34964	L/D-Färbung in der Durchflusszytometrie
Lymphoprep	Alere Technologies AS (Oslo, Norwegen)	Tel.: 04-03-9391/01
Magnesiumchlorid	Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Deutschland)	Nr. A537.1
Megafuge 2.0 RS	Heraeus (Hanau, Deutschland)	75015505
Neubauer Zählkammer	Brand (Wertheim, Deutschland)	717805
Nunc Zellkulturflaschen (175,0 cm2)	Thermo Scientific (Rockford, USA)	Artikel-Nr.: 159910
Paraformaldehyd, 16 %	Alfa Aesar, Haverhill, USA	43368.9M
PerfectSpin 24 Plus	Peqlab (Erlangen, Deutschland)	C2500-R-PL
PGE2 (1 mg/ml)	Pfizer (Berlin, Deutschland)	BE130681
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)	Lonza (Basel, Schweiz)	17-512F
RestoreTM Western Blot Stripping Puffer	Thermo Scientific, Rockford, USA	Artikel-Nr.: 21059
Schaukelplattform wt 15	Biometra (Göttingen, Deutschland)	Tel.: 042-590
RotiBlock	Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Deutschland)	Nr. A151.4
Roti-Load 1 (4x)	Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Deutschland)	Nr. K929.3
Rotiphorese Gel 30 (37,5:1)	Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Deutschland)	3029.1
RPMI 1640	Lonza (Basel, Schweiz)	12-167F
Natriumdodecylsulfat (SDS)	Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Deutschland)	2326,2
Thermomixer Komfort	Eppendorf (Hamburg, Deutschland)	Artikel-Nr.: 5355 000,011
TNF-α (10 μg/ml)	Peprotech (Hamburg, Deutschland)	300-01A
Tris	Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Deutschland)	4855,3
Trypanblau-Lösung (0,4 %)	Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Deutschland)	Nr. T8154
Tween 20	Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Deutschland)	9127.1
Whatman 0,2 μm Nitrozellulose-Membran	GE Healthcare (Solingen, Deutschland)	10600001
WhatmanTM Chromatographie-Papier 3 mm Chr	Fisher Scientific GmbH (Schwerte, Deutschland)	3030917

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