Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. Vorbereitungen vor Beginn der Operation
- Sterilisieren Sie chirurgische Instrumente (z. B. durch Autoklavieren).
- Verdünnen Sie das Virus auf die entsprechende Konzentration, die je nach Toxizität des verwendeten Virus und der Anfälligkeit des Rattenstamms variiert.
HINWEIS: Wenn wir beispielsweise das vesikuläre Stomatitis-Virus bei männlichen Buffalo-Ratten verwenden, injizieren wir in der Regel 107 Plaque-bildende Einheiten (PFU) in einem Volumen von 1 ml, was der maximal verträglichen Dosis in diesem Modell entspricht.
- Füllen Sie das Virus (mit aseptischer Technik) in 1-ml-Spritzen vor und setzen Sie 30-G-Nadeln auf, wobei darauf zu achten ist, dass die Luft aus der Spritze und der Nadel entfernt wird.
- Bereiten Sie den Operationssaal mit allen erforderlichen Materialien und Geräten vor und besprühen Sie den Bereich mit Ethanol zur Desinfektion. Füllen Sie ein kleines Gefäß mit steriler Kochsalzlösung (0,9 % Natriumchlorid, NaCl) zum Befeuchten von Mulltupfern und Applikatoren mit Wattespitze.
>2. Vorbereitung der Ratte
- Verabreichen Sie ein Analgetikum (wie vom örtlichen Tierpflege- und -verwendungsausschuss festgelegt) in der entsprechenden Dosis 30 Minuten vor Beginn des chirurgischen Eingriffs. Verabreichen Sie zum Beispiel eine hohe Dosis Metamizol (100-200 mg/kg).
- Betäuben Sie die Ratte mit einer Inhalationsanästhesie (Isofluran) oder injizierbaren (d. h. einer Mischung aus Medetomidin (0,15 mg/kg), Midazolam (2 mg/kg) und Fentanyl (0,005 mg/kg), auch bekannt als MMF). Verabreichen Sie Isolfluran mit 1-3% durch einen Verdampfer und passen Sie es nach Bedarf an, um die normale Atmung und Herzfrequenz aufrechtzuerhalten.
- Bevor Sie fortfahren, stellen Sie sicher, dass die Ratte vollständig sediert ist und keine Schmerzen empfinden kann, indem Sie den Fußballen zusammendrücken und auf eine Reaktion achten.
- Tragen Sie eine tierärztliche Augensalbe auf, um Trockenheit während der Narkose zu verhindern.
- Rasieren Sie den Bauchbereich vom Brustbein bis knapp über die Genitalien mit einem kleinen Tierhaarschneider. Achten Sie darauf, eine gründliche Rasur zu erreichen, ohne die Haut zu verletzen.
- Befestigen Sie die Ratte mit Klebeband an den Vorder- und Hintergliedmaßen auf dem Operationsbett und setzen Sie die Schnauze bei Verwendung einer Inhalationsnarkose in einen entsprechend großen Nasenkegel ein. Lege ein Heizkissen unter die Ratte, um die Körpertemperatur zu halten. Desinfizieren Sie den Bauchbereich mit einem chirurgischen Desinfektionsmittel, gefolgt von einer Alkoholspülung und dem Auftragen einer antiseptischen Farbe.
>3. Laparotomie
- Machen Sie mit einem kleinen, gebogenen Skalpell, wie z.B. #15, einen kleinen vertikalen Schnitt in der Hautschicht direkt entlang der Mittellinie. Verlängern Sie den Schnitt bis zum Xyphoid-Prozess. Als nächstes schneiden Sie die Muskelschicht ein, indem Sie sie vorsichtig mit einer Adson-Pinzette anheben, um einen Skalpellschnitt zu machen, und verlängern Sie dann den Schnitt mit einer chirurgischen Schere bis zum Xyphoid-Prozess. Achten Sie darauf, die Organe der Bauchhöhle nicht zu durchstechen oder die kleinen Gefäße auf beiden Seiten des Xyphoidfortsatzes zu beschädigen.
- Platzieren Sie einen Retraktor über den Bauch, um den Muskel und die Haut zu spreizen und den gesamten Bauchbereich freizulegen.
- Befeuchten Sie zwei 7,5 x 7,5 cmgroße 2 Mulltupfer mit steriler physiologischer Kochsalzlösung und verteilen Sie einen über die Oberseite der Operationsöffnung und einen über die Unterseite, wie in Abbildung 1A gezeigt.
>4. Isolierung der Leberarterie
- Heben Sie mit zwei angefeuchteten Wattestäbchen, die mit steriler physiologischer Kochsalzlösung angefeuchtet sind, den Darm und den Blinddarm vorsichtig aus der Bauchhöhle und legen Sie sie auf den unteren Mulltupfer. Falten Sie die Gaze um, um die Organe feucht zu halten und aus dem Weg zu halten.
- Heben Sie mit zwei angefeuchteten Wattestäbchen vorsichtig den linken lateralen Leberlappen an, der in diesem Stadium der vorherrschende Lappen ist. Klappen Sie den Lappen nach oben und schneiden Sie mit einer kleinen Federschere durch die faserige Membran an der Unterseite des Lappens, so dass der Lappen vollständig nach oben geklappt werden kann und auf dem zuvor platzierten Mulltupfer aufliegt. Falten Sie den Mulltupfer über den Lappen, um ihn an Ort und Stelle zu halten.
- Fahren Sie mit dem nächsten Lappen (dem vorderen Schwanz) fort, der nun der vorderste Lappen in Sichtweite ist. Präparieren Sie mit Hilfe eines Präpariermikroskops und einer feinen Pinzette die dünne Membran, die den Lappen umgibt, um sie freizugeben und frei nach oben klappen zu lassen. Legen Sie den Lappen zusammen mit dem linken Seitenlappen unter den Mulltupfer.
- Beobachten Sie den hinteren Schwanzlappen, der nun sichtbar sein wird. Wiederholen Sie Schritt 4.3, um den hinteren Schwanzlappen vollständig zu präparieren und ihn zusammen mit den zuvor platzierten Leberlappen nach oben und in die Gaze zu drehen.
- Direkt unter der ursprünglichen Position des Schwanzlappens befindet sich die Arteria hepatica communis, die nun sichtbar und leicht an ihrer starken Pulsation zu erkennen ist. Wenn Sie der Arterie nach rechts anatomisch folgen, beobachten Sie das dicke membranöse Material, das die gastroduodenalen und die eigentlichen Leberarterien verdeckt. Heben Sie das Material mit einer feinen Pinzette an und zerreißen Sie es vorsichtig, wobei Sie darauf achten, dass sich in diesem Bereich keine kleinen Gefäße befinden. Verwenden Sie Wattestäbchen, um eventuell auftretende Blutungen zu stoppen.
- Lokalisieren Sie die arteriellen Äste, die mit Hilfe eines Präpariermikroskops deutlich sichtbar sind, wenn die Membranen richtig präpariert sind.
- Präparieren Sie mit zwei feinen, atraumatischen Pinzetten vorsichtig die Arteria hepatica communis, die Arteria gastroduodenalis und die Arteria hepatica proper so, dass sie von den umgebenden Membranen befreit werden (Abbildung 1B).
>5. Vorbereitung der Arterie für die Injektion
- Führen Sie eine 7-0 Prolene-Naht unter die Arteria gastroduodenalis und binden Sie mit einem Mikronadelhalter eine permanente Ligatur am distalen Ende, direkt über der Bifurkation (siehe Abbildung 2 für die richtige Platzierung). Lassen Sie etwa 2 Zoll Nahtmaterial an den Enden verbleiben und klemmen Sie sie mit einem Nadelhalter fest, um die eingehaltene Arterie zu ziehen, wie in Abbildung 1C gezeigt.
- Platzieren Sie eine kleine Klemme auf der Arteria hepatic, um den Blutfluss vorübergehend zu blockieren (Abbildung 1C).
HINWEIS: Dies ist wichtig, um massive Blutungen zu vermeiden, sobald die Nadel aus der Arterie entfernt wird. Darüber hinaus ermöglicht die Blockade des arteriellen Blutflusses eine langsamere Virusverabreichung und eine bessere Transduktionseffizienz.
- Wichtig: Arbeiten Sie schnell, um die Zeitspanne zu begrenzen, in der der Blutfluss gestoppt wird - führen Sie die Injektion und die anschließende Ligatur der Arterie innerhalb von 5 Minuten nach dem Einklemmen der Arterie communis durch.
- Wenn möglich, erhöhen Sie die Vergrößerung am Präpariermikroskop so, dass die Arteria gastroduodenalis scharf fokussiert ist und groß genug erscheint, um die 30-G-Nadel genau einzuführen. Die Nadel der Injektionsspritze in das Lumen der Arteria gastroduodenalis einführen und langsam auf den Kolben drücken.
HINWEIS: Die richtige Platzierung der Nadel führt dazu, dass die injizierte Lösung direkt durch die richtige Leberarterie und in Richtung Leber fließt.
- Führen Sie die Injektion sehr langsam durch, um die Transduktionseffizienz zu maximieren.
- Sobald das gesamte Injektionsvolumen verabreicht wurde, ziehen Sie die Nadel langsam aus der Arterie zurück.
HINWEIS: Es sollte keine Blutung an der Injektionsstelle geben. Sollte es doch einmal zu einer Entblutung kommen, deutet dies darauf hin, dass die Klemme nicht richtig platziert ist und schnell eingestellt werden sollte.
>6. Schließen
- Führen Sie eine zweite 7-0-Prolene-Naht unter der Gastroduodenalarterie durch und binden Sie eine zweite permanente Ligatur über der Injektionsstelle.
- Entfernen Sie die Klemme von der Arteria hepatica communis. Vergewissern Sie sich, dass der Blutfluss durch die richtige Leberarterie in Richtung Leber wiederhergestellt wurde.
- Schneide die losen Enden der Ligaturen ab.
- Vergewissern Sie sich, dass es keine Blutungen gibt, bevor Sie den Darm und die Leber in die Bauchhöhle zurückführen. Achten Sie darauf, dass der Anhang in seiner ursprünglichen Ausrichtung zurückgegeben wird.
- Nähen Sie den Muskel und die Haut in getrennten Schichten mit 4-0 Vicryl Nahtmaterial mit einer gebogenen Nadel. Legen Sie durchgehende Nähte im Abstand von ca. 1 mm an und ziehen Sie sie fest.
- Verabreichen Sie während der Nahtphase ein Analgetikum wie Buprenorphin (0,05 mg/kg).
- Entfernen Sie die Ratte aus der Narkose. Wenn Isofluran angewendet wurde, sollte die Ratte innerhalb weniger Minuten wieder zu Bewusstsein kommen. Wenn MMF als injizierbare Anästhesie verwendet wurde, antagonisieren Sie es mit einer subkutanen Injektion von Atipamezol (0,75 mg/kg), Flumazenil (0,2 mg/kg) und Naloxon (9,12 mg/kg), wodurch die Wirkung der Anästhesie rückgängig gemacht wird und die Tiere innerhalb von 20 Minuten wieder das Bewusstsein erlangen können. Halten Sie Ratten während der ersten Aufwachphase mit einer Infrarot-Wärmelampe warm.
- Lassen Sie ein Tier nicht unbeaufsichtigt, bis es wieder genügend Bewusstsein erlangt hat, um das Brustbein aufrecht zu erhalten.
- Geben Sie ein Tier, das operiert wurde, nicht an andere Tiere zurück, bis es sich vollständig erholt hat.
