Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. Tiere
- Züchten Sie weibliche C57BL6/J-Mäuse bis zu einem Alter von 8 Wochen in individuell belüfteten Käfigen mit Mikroisolationsfiltern.
HINWEIS: Frauen werden bevorzugt, da die anatomische Konformation ihres äußeren Urogenitalapparates die Katheterisierung einfacher macht als bei Männern.
>2. Zellkultur
- Die Maus-Urothelkarzinom-Zelllinie MB49 ist in RPMI 1640-Medium zu halten, ergänzt mit 10 % hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum und 50 μg/ml Gentamicin bei 37 °C in befeuchtetem 5 % Kohlendioxid (CO2).
- Züchten Sie MB49-Zellen in T-75-Kolben auf 80 % Konfluenz. Trypsinisieren und resuspendieren bei 0,5 × 105 - 0,5 × 106 Zellen pro 150 μl phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) vor der Implantation in Mäuse.
>3. Intravesikales Tumorimplantat
- Anästhesieren Sie Mäuse mit einer Mischung aus den Anästhetika Zoletil und Xylor (33 mg/kg bzw. 20 mg/kg), die intraperitoneal injiziert werden.
- Legen Sie die Tiere in Rückenlage und befestigen Sie die Hinterbeine mit Klebeband am Ballen. Die Pfoten müssen ausreichend voneinander entfernt sein, um den Harnröhrengang für das Einführen des Katheters gut sichtbar und leicht zugänglich zu machen.
- HINWEIS: Für die Katheterisierung ist ein 24 G pädiatrischer Venenkatheter für 8 bis 10 Wochen alte Mäuse geeignet. Die Wahl des Katheters ist entscheidend, um ein Austreten von Flüssigkeit zwischen der Harnröhrenwand und dem Katheter zu vermeiden. Bei größeren oder älteren Mäusen müssen Katheter mit größerem Durchmesser verwendet werden.
- Kneifen Sie mit einer kleinen Zange eine Kante des äußeren Teils der Harnröhre zusammen und drehen Sie sie sehr vorsichtig in Richtung des "Kopfes" der Mäuse. Durch diese Aktion wird der Harnröhrenfleisch freigelegt.
- Entfernen Sie die innere Nadel des Katheters und führen Sie diese in einem Winkel von 45° in die Harnröhre ein, leicht orientiert zum "Schwanzende" der Mäuse. Erzwingen Sie nicht den Eintritt des Katheters; Im Falle eines Widerstands drehen Sie den Katheter einfach ganz vorsichtig, bis er in die Harnröhre rutscht. Wenn sich etwa 0,5-0,8 cm des Katheters in der Harnröhre befinden, platzieren Sie den Katheter vorsichtig parallel zum Schwanz der Mäuse und führen Sie ihn vollständig ein.
- Waschen Sie die Blase mit einer 1-ml-Spritze, deren Nadel in den Katheter eingeführt werden muss, vom Restharn, indem Sie 200-300 μl steriles PBS injizieren und die gesamte Flüssigkeit aus der Blase aspirieren.
- HINWEIS: Bei der Injektion von PBS füllt sich die Blase und zwischen den Hinterbeinen der Mäuse ist eine Schwellung sichtbar; dies bestätigt, dass die Katheterisierung korrekt ist. Die meisten Katheter haben ein Totvolumen, das bei der Berechnung des Injektionsvolumens berücksichtigt werden muss.
- Injizieren Sie mit einer sterilen 1-ml-Spritze 200 μl 0,1 N Salzsäure (HCl). Füllen Sie die Blase, um die gesamte Wand zu verbrennen. Nach 10 Sekunden wird die gesamte Säure entfernt und sofort neutralisiert, indem 200 μl 0,1 N Natriumhydroxid (NaOH) mit einer sterilen Spritze injiziert werden. Im Falle der Injektion der höchsten Anzahl von Zellen (0,5 × 106) ist der Ansäuerungsschritt nicht erforderlich.
- Saugen Sie die gesamte Restflüssigkeit ab und spülen Sie den Hohlraum sofort mit 300 μl sterilem PBS.
- Entleeren Sie die Blase durch Aspiration und injizieren Sie 150 μl PBS mit MB49-Zellen (Bereich 0,5 × 105 - 0,5 × 106) in die Blase. Lassen Sie die Spritze am Katheter befestigt, um ein Austreten von Zellen zu vermeiden. Es ist besser, die Spritze zu sichern, indem Sie sie mit Klebeband am Pad befestigen.
- Ziehen Sie nach 1 Stunde den Katheter vorsichtig aus der Harnröhre und legen Sie die Mäuse in den Käfig unter eine Glühlampe, bis sie wach sind: Dies geschieht in der Regel zwischen 1 und 2 Stunden nach Ende der Behandlung.
>4. Intravesikale Verabreichung von Helicobacter pylori Neutrophilen-aktivierendem Protein (HP-NAP)
- HINWEIS: Mindestens 3 Tage nach der Zellinstillation ist es möglich, mit der Behandlung zu beginnen.
- Katheterisieren Sie wie in den Schritten 3.1 bis 3.4 beschrieben. Zu diesem Zeitpunkt ist es nicht notwendig, die Blasenwand mit HCl zu verbrennen.
- Waschen Sie die Blase mit einer 1-ml-Spritze vom Restharn, indem Sie 200-300 μl steriles PBS injizieren und die gesamte Flüssigkeit aus der Blase aspirieren.
- Injizieren Sie 50 μg HP-NAP pro 150 μl PBS in die Blase. Lassen Sie die Spritze am Katheter befestigt, um ein Auslaufen der Proteinlösung zu vermeiden. Sichern Sie die Spritze, indem Sie sie mit Klebeband am Pad befestigen.
- Ziehen Sie nach 1 Stunde den Katheter vorsichtig aus der Harnröhre und legen Sie die Mäuse in den Käfig unter eine Glühlampe, bis sie aufwachen.
