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Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden von der local
überprüft.
Institutionellen Tierpflegeausschusses und der Veterinärprüfungsausschuss der JoVE. Alle Verfahren zur Probenentnahme wurden in Übereinstimmung mit den IRB-Richtlinien des Instituts durchgeführt.
>1. Erzeugung von viralen Ag-spezifischen CD8+ T-Zellen aus iPSCs (iPSC-CD8+ T-Zellen)
- Erstellung der retroviralen Konstrukte
Anmerkung: T-Zell-Rezeptor (TCR) α und β Gene sind mit der selbstspaltenden 2A-Sequenz verknüpft. Der retrovirale Vektor MSCV-IRES-DsRed (MiDR) ist DsRed+.
- Subklon-HBs183-191 (FLLTRILTI)-spezifische A2-restriktive human-murine Hybrid-TCR (s183 TCR)-Gene (Vα34 und Vβ28) in die MiDR, um das s183 MiDR-Konstrukt zu erzeugen (Abbildung 1A).
- Retrovirale Transduktion
HINWEIS: Die Platin-E (Plat-E)-Zellen werden für die Verpackung von Retroviren (mit s183 TCR-Genen) verwendet, die für die retrovirale Transduktion verwendet werden. Die Plat-E-Zellen sind effektive Retrovirus-Verpackungszellen, die den 293T-Zellen zugrunde liegen und die mittels einzigartiger Verpackungskonstrukte über den EF1α-Promotor entwickelt wurden, um retrovirale Strukturproteine, einschließlich gag, pol und ökotrope env, zu exprimieren.
- Auf einer 100-mm-Kulturschale 3 x 106 Plat-E-Zellen in 8 ml DMEM-Kulturmedium mit 10 % fötalem Kälberserum (FCS) in einem Inkubator bei 37 °C mit 5 % CO2 1 Tag vor der Transfektion säen.
- An Tag 0 transfizieren Sie das s183 MiDR-Konstrukt mit einem DNA-Transfektionsreagenz in die Plat-E-Zellen.
- An Tag 1 1 x 106 iPSCs (grün fluoreszierendes Protein [GFP]+) in eine gelatinevorbeschichtete Kulturplatte säen.
- An den Tagen 2 bis 3 wird Retroviren-haltiger Überstand aus der Plat-E-Zellkultur entnommen, um iPSCs mit dem s183 TCR in Gegenwart von 1,6-Dibromhexanlösung zu transduzieren.
- An Tag 4 trypsinisieren Sie die s183 TCR-Gen-transduzierten iPSCs, zentrifugieren 5 Minuten lang bei 400 x g und säen 3 × 105 iPSCs in einer 100-mm-Kulturschale, die mit 3 x 106 bestrahlten SNL76/7 (irSNL76/7) Feederzellen vorbeschichtet ist.
- Am 5. oder 6. Tag der Konfluenz trypsinisieren Sie die Zellen, zentrifugieren Sie 5 Minuten lang bei 400 x g und führen Sie den Prozess zur Zellsortierung durch. Gating an lebenden Zellen, sortieren Sie doppelt positive GFP- und DsRED-Zellen (die s183 TCR-Gen-transduzierten iPSCs) mit einem Hochgeschwindigkeits-Zellsortierer. Ähnlich wie in Schritt 1.2.5 werden die sortierten Zellen auf irSNL76/7-Feederzellen für die zukünftige Verwendung co-kultiviert.
- Differenzierung von HBV-spezifischen iPSC-CD8+ T-Zellen
HINWEIS: Die Stromazellen OP9-DL1/DL4 exprimieren sowohl die Notch-Liganden DL1 als auch DL4, und die Co-Kultivierung von iPSCs mit den iPSCs kann die Notch-Signalgebungs-vermittelte T-Zell-Differenzierung fördern.
- Züchten Sie s183-TCR-Gen-transduzierte iPSCs (s183/iPSCs) in der OP9-DL1-DL4-Zellmonoschicht in α-Minimum-Medium (MEM)-Medien mit 20 % fötalem Rinderserum (FBS). Den murinen FMS-ähnlichen Tyrosinkinase-3 (Flt3)-Liganden (mFlt-3L; Endkonzentration = 5 ng/ml) in die Kultur aufnehmen.
- An Tag 0 0,5–1,0 x 105 S183/iPSCs in einer 10 cm großen Kulturschale säen, die zuvor mit OP9-DL1-DL4-Zellen gezüchtet wurde. Stellen Sie sicher, dass sich die OP9-DL1-DL4-Zellen in einem Zustand von 80 % bis 90 % Konfluenz befinden.
- Spülen Sie die iPS-Zellen an Tag 5 mit 10 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) aus, aspirieren Sie die PBS, geben Sie diese zu 4 ml 0,25 % Trypsin und inkubieren Sie sie 10 Minuten lang in einem 37 °C-Inkubator. Fügen Sie anschließend weitere 8 ml iPSC-Medium hinzu, um den Trypsinverdau zu beenden. Alle Verdauungslösungen, die die Zellen enthalten, ansammeln und bei 400 x g für 5 min bei 15–30 °C zentrifugieren.
- Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 10 ml iPSC-Medien. Die Zellsuspension auf eine neue 10 cm Petriplatte umfüllen und in einem Inkubator 30 min bei 37 °C inkubieren.
- Sammeln Sie nach 30 Minuten das iPSC-Medium mit den schwimmenden Zellen. Die Zellsuspension durch ein 70 μm Zellsieb passieren und die Zellzahl berechnen.
- Entkernen Sie 5 x 105 Zellen in der Kulturschale zuvor gezüchtete OP9-DL1-DL4-Zellen mit einem Zustand von 80 % bis 90 % konfluent, wie in Schritt 1.3.1.
beschrieben
Anmerkung: Für die T-Zell-Differenzierung müssen die iPSC-abgeleiteten Zellen alle 2-3 Tage mit einer frischen Schicht der OP9-DL1-DL4-Zellen neu ausgesät werden.
- Auswertung
- Morphologische Veränderungen differenzierender iPSCs
- Beobachten Sie Zellen an verschiedenen Tagen unter dem Mikroskop.
Anmerkung: Am 5. Tag weisen die Kolonien mesodermähnliche Merkmale auf und weisen eine klassische spindelförmige Morphologie auf, die menschlichen dermalen Fibroblasten ähnelt, und ein anhaltendes Wachstum in vitro. Am 8. Tag beginnen kleine runde Zellhaufen zu erscheinen.
- Analyse differenzierender iPSCs mittels Durchflusszytometrie
- Analysieren Sie an verschiedenen Tagen der Co-Kultur iPSC-abgeleitete Zellen, wie zuvor beschrieben (Abbildung 1B, C).
- Funktionsanalyse differenzierender iPSCs
- Am 28. Tag der Co-Kultur werden iPSC-CD8+ T-Zellen aus Kulturen entnommen, indem die schwimmenden Zellen entnommen werden, die übrig gebliebenen Zellen mit 0,25 % Trypsin trypsinisiert werden, in 8 ml iPSC-Medien re-suspendiert, 5 Minuten lang bei 400 x g bei 15–30 °C zentrifugiert, das Medium entfernt und die Zellen dann in 10 ml Medium resuspendiert werden.
- Bewahren Sie die resuspendierten Zellen in einer frischen 10 cm Schale in einem 37 °C Inkubator für 30 min auf und bauen Sie die schwimmenden Zellen zusammen. Spülen Sie die Zellen dann einmal mit einem kalten PBS aus.
- Inkubieren Sie 3 x 106 T zell-depletierte Milzzellen (CD4-CD8-) aus Milz von H-2 Klasse I Knockout-, HLA-A2.1-transgenen (HHD) Mäusen mit 5 μM s183 Peptid (FLLTRILTI) in 200 μL Medium bei 4 °C für 30 min.
- Erzeugen Sie eine Mischung aus iPSC-CD8+ T-Zellen mit Splenozyten, die mit dem Peptid s183 gepulst wurden (T-Zellen: Splenozyten = 1:4; verwenden Sie 0,75 x 106 T-Zellen). Inkubieren Sie das Zellgemisch bei 37 °C in einem CO2 -Inkubator für 40 h. In den letzten 7 h werden 4 μl verdünntes Brefeldin A in die Kultur gegeben (Endkonzentration von 1.000x, die in 1x Kulturmedien verdünnt wird), um Transportprozesse während der Zellaktivierung zu blockieren.
- Färben Sie die Zellen und führen Sie eine durchflusszytometrische Analyse von intrazellulärem Interferon-gamma (IFN-γ) durch, wie zuvor beschrieben (Abbildung 2).
>2. Induktion der HBV-Replikation durch hydrodynamische Abgabe des HBV-Plasmids
HINWEIS: Das pAAV/HBV1.2-Konstrukt wurde wie zuvor beschrieben generiert. Die vollständige DNA von HBV 1.2 wird in den Vektor pAAV eingebaut.
- Hydrodynamische Verabreichung von HBV-Plasmid durch die Schwanzvene
- Erhitzen Sie HHD-Mäuse mit einer Wärmelampe 5 Minuten lang im Käfig, um die Schwanzvene zu erweitern.
- Halten Sie das Tier mit einem Fixierer fest und reinigen Sie die Mäuseschwänze mit 70%igem Ethanolspray.
- Abgabe des Plasmids in die Leber.
- Messen Sie das Körpergewicht der Maus mit einer Messwaage.
- Verdünnen Sie 10 μg HBV-Plasmid in dem 8%igen Äquivalent der Körpermasse PBS (z. B. 1,6 ml für eine 20-g-Maus). Laden Sie das verdünnte Plasmid in eine 3-ml-Spritze mit einer 26 G × 1⁄2" (0,45 × 12 mm) Injektionsnadel.
- Lokalisiere eine der beiden seitlichen Schwanzvenen im mittleren Drittel des Schwanzes und positioniere die Nadel in einer der beiden Seitenvenen. Die Injektion mit HBV-Plasmid durch die Schwanzvene innerhalb von 3 - 5 s verabreichen.
- Quantifizierung der Virämie aus dem Blutserum infizierter Mäuse
Anmerkung: Die HBV-Replikation erfolgt vom 3. bis 35. Tag im Mausserum. Die DNA-Replikation erreicht am 7. Tag ihren Höhepunkt und nimmt allmählich ab. Die HBV-DNA wird erst am 35. Tag aus dem Serum entfernt.
- Entnahme von Blutserum von infizierten Mäusen
- Sammeln Sie 3, 5, 7 und 10 Tage nach der Infektion etwa 0,1 ml Blut in einem Mikrozentrifugenröhrchen von jeder Maus durch retroorbitale Blutung in einem 1,5 ml-Mikrozentrifugenröhrchen und inkubieren Sie es dann 20 Minuten lang bei Raumtemperatur (RT).
- Die Probe wird bei 6.000 x g für 15 min bei 4 °C zentrifugiert und der Serumüberstand nach der Zentrifugation entnommen.
- Reinigen Sie die DNA aus dem Blutserum mit einem handelsüblichen DNA-Extraktionskit gemäß den Empfehlungen des Herstellers. Kurz gesagt, lysieren Sie die Zellen in einer Säule auf Siliziumdioxidbasis, führen Sie die Waschungen durch und extrahieren Sie DNA, indem Sie 100 % Ethanol in die Elutionssäule geben und 1 Minute lang bei 6000 x g zentrifugieren. Eluieren Sie die DNA in 50 μl RNase-freiem Wasser.
- Verwenden Sie 100 ng HBV-DNA aus der Elution für die Echtzeit-PCR-Analyse. Verwenden Sie die folgenden Primer und Sonden: vorwärts 5' TAGGAGGCTGTAGGCATAAATTGG 3'; rückwärts 5' GCACAGCTTGGAGGCTTGT 3'; Sonde 5' TCACCTCTGCCTAATC 3'.
- Verwenden Sie das HBV-Genom, das das Plasmid (pAAV/HBV1.2) enthält, für die Standardkurve und führen Sie eine real-time PCR mit einem Gesamtvolumen von 10 μl durch (Abbildung 3).
- Richten Sie die PCR-Reaktion in einem Gesamtvolumen von 10 μl ein, wie in Tabelle 1 gezeigt.
- Richten Sie das PCR-Programm im Thermocycler ein, wie in Tabelle 2 gezeigt. Die programmierte Temperaturübergangsrate beträgt 20 °C/s für das Denaturieren/Glühen und 5 °C/s für die Verlängerung. Messen Sie die Fluoreszenz am Ende der Glühphase für jeden Zyklus für die Echtzeit-PCR-Überwachung.
>3. Reduktion der HBV-Replikation durch ACT von viralen Ag-spezifischen iPSC-CD8+ T-Zellen
- Adoptiver Zelltransfer (ACT)
- s183/iPSCs (1.3.7) werden auf den OP9-DL1-DL4-Stromazellen in Gegenwart von mFlt-3L und mIL-7 für 8 Tage differenziert, wie in Abschnitt 1.3 beschrieben.
- Sammeln Sie an Tag 22 iPSC-CD8+ T-Zellen von der 10-cm-Platte mit Trypsin, waschen und resuspendieren Sie dann jede 10-cm-Platte in 10 ml frischem Medium. Geben Sie die Zellen auf eine frische 10-cm-Platte und kehren Sie für 30 Minuten in den Inkubator zurück, wie in Abschnitt 1.3 beschrieben. Nach 30 Minuten schwimmende Zellen sammeln.
- Verwenden Sie ein 70-μm-Nylonsieb zum Passieren von Zellen, um Zellcluster zu eliminieren und die Zellzahl zu zählen. Passen Sie die Zellen an eine Konzentration von 1,5 x 107 Zellen/ml in kalter PBS-Lösung an und verwenden Sie ein 70 μm Nylonsieb, um die Zellen zu passieren und Zellcluster bei Bedarf wieder zu eliminieren. Halten Sie die Zellen auf Eis, bis die ACT.
- Injizieren Sie 200 μl Zellsuspension (3 x 106 Zellen) in 4–6 Wochen alte HHD-Mäuse durch die Schwanzvene.
- Induktion der HBV-Replikation
- Am Tag 14 nach dem Zelltransfer ist die hydrodynamische Verabreichung des HBV-Plasmids durch die Schwanzvene durchzuführen, wie in Abschnitt 2.1 beschrieben.
Tabelle 1: PCR-Reaktionsvolumen
| DNA-Vorlage | 2 ml |
| DNA-Master-Hybridisierungsgemisch (Taq-DNA-Polymerase, PCR-Reaktionspuffer, 10 mM MgCl2 und dNTP-Gemisch) | 1 ml |
| 25 mM MgCl2 | 0,8 ml |
| 0,3 μM die Sonde | 3 ml |
| 5 μM von jedem Primer | 3,2 ml |
| gesamt | ca. 10 ml |
Tabelle 2: PCR-Programm
| Denaturierung | Temperatur
95 °C | Zeit
5 Sek. |
| Glühen | 53 °C | 10 Sek. |
| Erweiterung | 72 °C | 20 Sek. |
| 5 °C | |
