Method Article

Unterdrückung der Hepatitis-B-Virusreplikation mit viralen Antigen-spezifischen T-Zellen

July 8th, 2025

In This Article

Abstract

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Quelle: Xiong, X., et al. Aus Stammzellen stammende virale Ag-spezifische T-Lymphozyten unterdrücken die HBV-Replikation bei Mäusen. J. Vis. Exp. (2019).

Das Video zeigt einen Assay, bei dem von humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSC) abgeleitete CD8+ T-Zellen verwendet werden, um die Replikation des Hepatitis-B-Virus (HBV) in Mäusen zu hemmen. Diese T-Zellen, die mit HBV-spezifischen Rezeptoren versehen sind, werden in transgene Mäuse übertragen. Replikationskompetente HBV-Genom-Plasmide werden dann direkt in die Leber injiziert und ermöglichen so die Aufnahme viraler DNA. Sobald virale Antigene exprimiert und von hybriden MHC-I-Molekülen präsentiert werden, erkennen die manipulierten T-Zellen diese Komplexe und binden an sie. Dies löst die Freisetzung zytotoxischer Moleküle aus, was zur Zerstörung von HBV-infizierten Leberzellen und zur Unterdrückung der Virusreplikation führt.

Protocol

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden von der local
überprüft. Institutionellen Tierpflegeausschusses und der Veterinärprüfungsausschuss der JoVE. Alle Verfahren zur Probenentnahme wurden in Übereinstimmung mit den IRB-Richtlinien des Instituts durchgeführt.

>1. Erzeugung von viralen Ag-spezifischen CD8+ T-Zellen aus iPSCs (iPSC-CD8+ T-Zellen)

  1. Erstellung der retroviralen Konstrukte
    Anmerkung: T-Zell-Rezeptor (TCR) α und β Gene sind mit der selbstspaltenden 2A-Sequenz verknüpft. Der retrovirale Vektor MSCV-IRES-DsRed (MiDR) ist DsRed+.
      ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-results-1
Abbildung 1: Erzeugung von HBV-viralen Ag-spezifischen iPSC-CD8+ T-Zellen.

Maus-iPSCs werden mit den folgenden retroviralen Konstrukten transduziert: HBs183-91 TCR (MiDR-s183 TCR) oder OVA257–264 TCR (MiDR-OVA TCR), und die transduzierten iPSCs werden mit OP9-DL1/DL4 Stromazellen zur Differenzierung der T-Linie cokultiviert. (A) Schematische Darstellung des r.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Es wurden keine Interessenkonflikte angegeben.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
HHD-MäuseInstitut Pasteur, Paris, FrankreichH-2 Klasse I Knockout, HLA-A2.1-transgene (HHD) Mäuse
iPS-MEF-Ng-20D-17RIKEN ZellbankAPS0001
SNL76/7ATCCSCRC-1049
OP9ATCCCRL-2749
pAAV/HBV1.2-PlasmidDr. Dr. Pei-Jer Chen (Nationales Taiwan Universitätskrankenhaus, Taiwan)HBV-DNA-Konstrukt
HBs183-91(s183) (FLLTRILTI)-spezifische TCR-GeneDr. Adam J. Gehring (Toronto General Hospital Research Institute, Toronto, Kanada)FLLTRILTI-spezifische A2-restriktive human-murine Hybrid-TCR-Gene (Vα34 und Vβ28)
OVA257–264-spezifische TCR-GeneDr. Dario A. Vignali (Universität Pittsburgh, PA)SIINFEKL-spezifische H-2Kb-restriktive TCR-Gene
Anti-CD3 (17A2)-AntikörperBiolegende100236
Anti-CD44 (IM7)-AntikörperBD Pharmingen103012
Anti-CD4 (GK1.5) AntikörperBiolegende100408
Anti-CD8 (53-6.7) AntikörperBiolegende100732
Anti-IFN-γ (XMG1.2) AntikörperBiolegendeArtikel-Nr.: 505810
Anti-TNF-a (MP6-XT22) AntikörperBiolegende506306
α-MEMInvitrogenNr. A10490-01
Anti-HBs-AntikörperThermo FischerMA5-13059
ACK Lysis PufferLonza10-548E
Brefeldin ASigmaNr. B7651
DMEMInvitrogenABCD1234
FBSHyklonNr. SH3007.01
FACSAria Fusion ZellsortiererBdArtikel-Nr.: 656700
GelatineMilliporeSigmaNr. G9391
GeneJammerAgilentArtikel-Nr.: 204130
HLA-A201-HBs183-91-PE PentamerProimmunNr. F027-4A - 27
HRP Anti-Maus-SekundärantikörperInvitrogenNr. A27025
mFlt-3LPeprotech250-31L
mIL-7PeprotechNr. 217-17
Nuklease S7Roche10107921001
ParaformaldehydMilliporeSigmaNr. P6148-500GVorsicht: Allergen, krebserregend, giftig
Permeabilisierungs-PufferBiolegende421002
PolybreneMilliporeSigma107689
ProLong™ Gold Antifading-Eindeckmittel mit DAPIInvitrogenNr. P36931
QIAamp MinElute Virus Spin KitQiagenArtikel-Nr.: 57704

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Hepatitis B VirusViral Antigen Specific T CellsiPSC Derived CD8 T CellsHydrodynamic Plasmid DeliveryHBV Genome PlasmidsTail Vein InjectionAntigen Presenting MoleculesCytotoxic Molecule ReleaseHBV Infected Liver CellsViral Replication Suppression

Related Articles