Eine zellbasierte Therapie für Autoimmunarthritis im Mausmodell

Zusammenfassung

Quelle: Haque, M. et al., Entwicklung von Stammzell-abgeleiteten antigenspezifischen regulatorischen T-Zellen gegen Autoimmunität.J. Vis. Exp. (2016)

Dieses Video zeigt eine zellbasierte Therapie für Autoimmunarthritis bei Mäusen. iPSC-abgeleitete T-regulatorische Zellen, die Ovalbumin-spezifische Rezeptoren exprimieren, werden mit methyliertem Rinderserumalbumin (mBSA) injiziert, das in einem Adjuvans emulgiert wird. Murine Antigen-präsentierende Zellen (APCs) verarbeiten und präsentieren das mBSA an T-Zellen, was zur Aktivierung der T-Zellen und zur Migration zur Synovialmembran des Kniegelenks führt. Nachfolgende Injektionen umfassen mBSA allein im linken Knie und eine Kombination aus mBSA und Ovalbumin im rechten Knie. Im linken Knie löst die Immunantwort auf mBSA Arthritis aus, während im rechten Knie T-regulatorische Zellen, die mit Ovalbumin interagieren, die Entzündung mildern und die Arthritis-Symptome verbessern.

Protokoll

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

>1. In vivo Reifung und Unterdrückung von Autoimmunarthritis

1. Generieren Sie die Konstrukte, die in der retroviralen Transduktion verwendet werden sollen, indem Sie die OT-II-T-Zell-Rezeptor-Gene (TCR) und das Forkhead-Box-Protein 3 (FoxP3) in das MiDR-Plasmid subklonieren, das mit dem selbstspaltenden Peptid 2A verknüpft ist, um das MiDR-TCRα-2A-TCRβ-2A-FoxP3-Konstrukt herzustellen.
2. Durchführung einer retroviralen Transduktion von induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) unter Verwendung von Plat E-Zellen als Verpackungszelllinie.
3. In vivo Differenzierung und Arthritis-Induktion bei Mäusen.
   1. Differenzierung von OT-II TCR/FoxP3-transduzierten iPSCs (OT-II-FoxP3/iPSCs), FoxP3-transduzierten iPSCs und DsRed-transduzierten iPSCs auf den OP9-DL1-DL4-I-A^b Stromazellen in Gegenwart der Zytokine mFlt-3L und mIL-7 für 8 Tage.
   2. An Tag 0 werden OP9-DL1-DL4-I-A^b-Zellen mit einer Mindestdichte von 10⁴ Zellen/^cm2 unter Verwendung von OP-9-Medien (α-MEM-Medien, die 20 % fötales Kälberserum (FCS) und 2,2 g/l Natriumbicarbonat enthalten, ausgesät. Platte 1 x 10⁶ Zellen pro 10 cm Schale.
   3. An Tag 3, wenn OP9-DL1-DL4-I-A B-Zellen zu 80-90 % konfluent werden, entfernen Sie das Medium und säen Sie 0,5 - 1 x 10⁵ iPSCs über OP9-DL1-DL4--I-A B-Zellen in OP-9-Medien aus.
      HINWEIS: Dies etabliert die Co-Kultur von iPSCs auf OP9-DL1-DL4-I-A^b-Zellen und gilt als Tag 0 der Differenzierung.
   4. An Tag 5 wird das Medium durch Aspiration aus der 10-cm-Schale genommen, die Zellen mit 10 ml 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen und das PBS aspiriert. 4 ml 0,25 % Trypsin zugeben und 10 min bei 37 °C inkubieren. Geben Sie weitere 8 ml iPSC-Medien in die Zellen, suspendieren Sie sie wieder und zentrifugieren Sie sie bei 400 x g für 5 min bei Raumtemperatur.
      1. Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 10 ml iPSC-Medien. Inkubieren Sie diese resuspendierten Zellen auf einer frischen 10-cm-Schale und kehren Sie für 30 Min. in den Inkubator zurück
         HINWEIS: Entfernen Sie die Feederzellen OP9-DL1-DL4-I-A^B und lassen Sie die differenzierenden iPSCs im Medium. Pflegen Sie OP9-DL1-DL4-I-A^b-Zellen kontinuierlich, um eine Konfluenz von 80 - 90 % für weitere Co-Kulturen zu erreichen.
      2. Nach 30 Minuten sammeln Sie die schwimmenden Zellen, filtrieren Sie sie durch ein 70-μm-Zellsieb und zählen Sie sie mit einem Hämozytometer.
   5. 5 x 10⁵ iPS-Zellen werden auf eine frische 80 - 90%ige Konfluente von OP9-DL1-DL4-I-A^b-Zellen in OP9-Medien ausgeimpft. Ergänzen Sie das Medium mit mFlt-3L in einer abschließenden Konzentration von 5 ng/ml.
   6. Trypsinisieren Sie alle drei Arten von Zellen aus der 10-cm-Platte und resuspendieren Sie die Zellen aus jeder 10-cm-Platte in 10 ml frischem Medium. Geben Sie die Zellen auf eine frische 10 cm Platte und kehren Sie für 30 Minuten in den Inkubator zurück. Nach 30 Minuten schwimmende Zellen sammeln.
   7. Führen Sie die Zellen durch ein 70-μm-Zellsieb, um Zellcluster zu entfernen und mit einem Hämozytometer zu zählen. Stellen Sie die Zellen auf eine Konzentration von 1,5 x 10⁷ Zellen/ml in kaltem PBS ein und filtern Sie bei Bedarf erneut. Halten Sie die Zellen auf Eis, bis die Zellen adoptiv in Mäuse übertragen werden.
   8. Injizieren Sie 200 μl der Zellsuspension (3 x 10,⁶ Zellen) durch die Schwanzvene in drei verschiedene Gruppen von 4 - 6 Wochen alten weiblichen C57BL/6-Mäusen.
   9. Am 10. Tag, nach dem Zelltransfer, injizieren Sie den Mäusen mit einer 1-ml-Spritze 100 μg methyliertes Rinderserumalbumin (mBSA), das in Freunds vollständigem Adjuvans emulgiert ist, an der Basis des Schwanzes.
   10. Betäuben Sie die Mäuse am 17. Tag mit einem Isofluran-Verdampfer. Verwenden Sie 4 - 5 % Isofluran für die Induktion und 1 - 2 % für die Erhaltung. Induktion von Arthritis durch intraartikuläre Injektion von 20 μg mBSA in 10 μl PBS im linken Kniegelenk und von 20 μg mBSA und 100 μg ganzem Ovalbumin (OVA) in 10 μl PBS im rechten Kniegelenk. Futter und eine Gelpackung können auf den Einstreuboden gelegt werden, nachdem sich eine Arthritis entwickelt hat. Die Mäuse werden eingeschläfert: Body Condition Score (BCS) von 2/5 oder moribund, schwere Kachexie und/oder anhaltendes Liegen (ein Zeitraum von 24 Stunden) und Schweregrad von 4. Bei Score 4 umfassen Erythem und schwere Schwellungen den Knöchel. Fuß und Finger oder Ankylosen der Gliedmaßen.
4. Charakterisierung der OT-II TCR/FoxP3-transduzierten iPSCs.
   1. Verwenden Sie ein Fluoreszenzmikroskop (20X), um nicht fixierte lebende DsRed⁺ GFP⁺-Zellen sichtbar zu machen.
   2. Untersuchen Sie die Genintegration und -expression sowohl durch Western-Blot als auch durch Durchflusszytometrie.
5. Assay zur Unterdrückung von Arthritis
   1. Messen Sie die Schwellung beider Knie der Mäuse vor der Arthritis-Induktion, indem Sie einen Messschieber verwenden, um eine Ausgangslinie festzulegen.
   2. Befolgen Sie die Schritte (1.3.1 - 1.3.10) für die Arthritis-Induktion und den Treg-Transfer. Messen Sie die Knie der Maus mit einem Messschieber nach dem Treg-Transfer.
   3. Berechnen Sie die prozentuale Zunahme des Kniedurchmessers: Prozentuale Zunahme = (Kniedurchmesser an Tag 1 - Kniedurchmesser an Tag 0) / Kniedurchmesser an Tag 0.
6. Histologische Messung der Gelenkzerstörung und der Infiltration von Entzündungszellen in den Knien (Abbildung 1).
   1. Am 7. Tag nach der Arthrose-Induktion werden die Mäuse durch Inhalation von Kohlendioxid (CO₂) eingeschläfert, gefolgt von einer Gebärmutterhalsluxation. Entfernen Sie die Haare von den Knien mit einer elektrischen Haarschneidemaschine und entfernen Sie die Knie durch einen chirurgischen Eingriff.
   2. Entfernen Sie die Haut von den Beinen, indem Sie mit einer stumpfen Schere einen Schnitt in das Hinterbein machen und die Haut über den Oberschenkel bis zum Knöchel schneiden. Ziehen Sie die Haut über Bein und Fuß vorsichtig ab, um den Muskel freizulegen. Entferne den Muskel vorsichtig aus dem Bein, ohne das Kniegelenk zu beschädigen.
      1. Schneiden Sie das Hinterbein knapp über dem Becken-/Hüftgelenk und schneiden Sie das Schienbein mit einer scharfen Präparierschere.
   3. Fixieren Sie die Knie 48 Stunden lang in 4% Formalin. Entkalken Sie die Knie mit 2,5 M Ameisensäure; spülen Sie dreimal für 3 Minuten mit Xylol, spülen Sie zweimal mit 100% Ethanol, spülen Sie zweimal mit 95% Ethanol, spülen Sie zweimal für 2 Minuten in entionisiertem Wasser und entkalken Sie in 1 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA). Bei Unterkochtemperatur (90 °C) 20 Min. behandeln.
   4. Entfernen Sie beide Knie, fixieren Sie es mit 10% Formalin und verkalken Sie es in Formical-4. Das Gewebe in Paraffin einbetten, bei 4 μm schneiden, mit Hämatoxylin und Eosin (H & E) oder Safranin O färben und unter dem Mikroskop betrachten.

Ergebnisse

Abbildung 1: Adoptiver Transfer von Ag-spezifischen iPSC-Tregs verbessert AIA bei Mäusen. Murine iPSCs wurden mit dem retroviralen Konstrukt MiDR, MiDR-FoxP3 oder MiDR-TCR-FoxP3 transduziert und auf den OP9-DL1/DL4/I-A^b-Zellen co-kultiviert. An Tag 7 wurden die gentransduzierten Zellen (3 × 10⁶/Maus) adoptiv in weibliche C57BL/6-Mäuse übertragen, die zwei Woc...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
C57BL/6j Mäuse	Jackson-Labor	664
α-MEM	Invitrogen	Nr. A10490-01
FBS	Hyklon	Nr. SH3007.01
Polybrene	Sigma	107689
Genejammer	Integrierte Wissenschaft	Artikel-Nr.: 204130
mFlt-3L	PEPROTECH	250-31L
mIL-7	PEPROTECH	Nr. 217-17
mBSA	Sigma	Nr. A7906
Albumin aus Eizellen	Avantor	Tel.: 0440-01
Cfa	Difco	2017014
Schwanzviner-Rückhaltesystem	Braintree wissenschaftlich	RTV 150-STD
Paraformaldehyd	Sigma	Nr. P6148-500G	Achtung: Allergen, krebserregend, Giftig

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