Eine ex vivo-Technik zur Erzeugung tumorspezifischer chimärer Antigenrezeptor-T-Zellen

Zusammenfassung

Quelle: Riccione, K., et al. Generierung von CAR-T-Zellen für die adoptive Therapie im Rahmen der Standardbehandlung des Glioblastoms. J. Vis. Exp. (2015).

Dieses Video demonstriert eine Technik zur ex vivo Erzeugung von Tumorantigen-spezifischen chimären Antigenrezeptor (CAR) T-Zellen. Retrovirale Vektoren, die transgene RNA tragen, werden mit Milzzellen in einem mit Interleukin-2 supplementierten Medium gemischt, um das Überleben und die Proliferation von T-Zellen zu fördern. Das Gemisch wird dann auf eine mit rekombinanten menschlichen Fibronektinfragmenten beschichtete Platte überführt und zentrifugiert, um die Fusion des Virus mit der Zelle zu erleichtern, so dass sich die RNA in das Wirtsgenom integrieren und oberflächengebundene CARs produzieren kann, die auf das Tumorantigen abzielen.

Protokoll

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

>1. Splenektomie und T-Zell-Vorbereitung

Tag 0:

1. Gießen Sie 10 ml T-Zell-Medien (TCM) in einen 50 ml Kegel und legen Sie ihn zur Milzentnahme auf Eis.
2. Töten Sie die entsprechende Anzahl von Tieren durch CO₂ -Erstickung und sekundäre Enthauptung: Setzen Sie die Tiere in einen Käfig, der CO₂ mit einer Durchflussrate von 10-30 % Käfigvolumen/Minute gemäß den Richtlinien der American Veterinary Medical Association (es dürfen nicht mehr als 5 Tiere gleichzeitig getötet werden) erhalten, bis die Atmung beendet ist und danach zwei Minuten lang. Tiere aus der CO_{2 -}Kammer entnehmen und enthaupten.
   Anmerkung: Eine Milz einer 6–12 Wochen alten weiblichen C57BL/6-Maus liefert etwa 4,5-5 x 10⁷ Splenozyten. Hier werden 4 Milz für ca. 200 x 10⁶ Zellen geerntet.
3. Legen Sie die Maus so hin, dass ihre rechte Seite nach oben zeigt, und besprühen Sie sie mit 70 % Ethanol. Fassen Sie mit der Pinzette eine dünne Hautfalte unterhalb des linken Brustkorbs und schneiden Sie mit der Schere einen leichten Schnitt. Ziehen Sie die Haut ab, greifen Sie vorsichtig mit einer Pinzette nach einer dünnen Falte des Bauchfells und schneiden Sie einen kleinen Hohlraum.
4. Die Milz ist ein kleines, längliches, dunkelrotes Organ, das einer abgeflachten Bohne ähnelt. Fassen Sie die Milz vorsichtig mit der Pinzette und schneiden Sie das umgebende Bindegewebe ab. Legen Sie die herausgeschnittene Milz in den Konus mit 10 ml TCM auf Eis.
5. Gießen Sie die Milz über ein 70-μm-Netzzellensieb und disaggregieren Sie, indem Sie mit dem stumpfen Ende der Innenseite einer 5-ml-Spritze zerdrücken, um eine einzellige Suspension zu erzeugen. Pro Netzsieb sollten maximal zwei Milz disaggregiert werden.
6. Verwenden Sie eine kleine Menge TCM, um das Sieb nach der Disaggregation vorsichtig zu waschen, um verbleibende Splenozyten zu sammeln. Bündeln Sie alle disaggregierten Milz in einer einzelligen Suspension. Bringen Sie das endgültige Volumen mit TCM für einen Waschgang auf 50 ml und schleudern Sie 10 Minuten lang bei 300 x g.
7. Bereiten Sie eine Lösung aus 1x Lysepuffer vor, indem Sie 5 ml 10x Lysepuffer zu 45 ml sterilem Wasser hinzufügen. Um rote Blutkörperchen zu eliminieren, resuspendieren Sie das Pellet in 5 ml 1x Lysepuffer pro Milz in einem konischen 50-ml-Kissen und mischen Sie es gut, indem Sie es vorsichtig auf und ab pipettieren. Bei Überschreitung von 5 Milz ist ein 250-ml-Zentrifugenröhrchen zu verwenden. Stellen Sie das konische Röhrchen oder das Zentrifugenröhrchen für 5 min in ein 37 °C heißes Wasserbad.
8. Entfernen Sie die Lysereaktion aus dem Wasserbad und fügen Sie TCM im Verhältnis 1:1 mit Lysepuffer hinzu, um die Reaktion zu neutralisieren. Durch Schleudern bei 300 x g 10 Min. waschen.
9. Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet vollständig in TCM (2 ml/Milz, 8 ml insgesamt für 4 Milz), indem Sie auf und ab pipettieren.
10. Zählen Sie die Zellen, indem Sie 10 μl Zellsuspension zu 190 μl Trypanblau (1:20 Verdünnung) hinzufügen. Multiplizieren Sie die in einem der vier gerasterten Quadrate erhaltene Anzahl mit 20 x 10⁴ x Gesamtvolumen (8 ml), um die Gesamtzellzahl zu erhalten (z. B. 125 Zellen x 20 x 10⁴ x 8 ml = 200 x 10⁶ Splenozyten).
11. Verdünnen Sie die Zellen auf eine Konzentration von 2 x 10⁶ Zellen/ml in der TCM, ergänzt mit 2 μg/ml Concanavalin A (ConA) und 50 IE/ml rekombinantem humanem Interleukin-2 (rhIL-2). Für 200 x 10⁶ Splenozyten wird also 92 ml Medium zu 8 ml Zellen, 200 μg ConA und 5.000 IE rhIL-2 hinzugefügt.
12. Fügen Sie 2 ml-Zellen zu jeder Vertiefung von 24-Well-Gewebekulturplatten hinzu, so dass sich 4 x 10⁶ Zellen in jeder Vertiefung befinden (z. B. benötigen 100 ml Zellen etwa 4 Platten).
13. Über Nacht bei 37 °C mit 5 % CO₂ inkubieren.

>2. Transduktion

Tag 1:

1. Berechnen Sie die Anzahl der 24-Well-Platten, die für die Transduktion benötigt werden, indem Sie die Anzahl der entnommenen Milz mit 2 multiplizieren (8 Platten werden für 4 Milz benötigt).
2. Berechnen Sie als Nächstes das erforderliche Volumen der rekombinanten humanen Fibronektinfragment (RHFF)-Lösung, die zum Beschichten der Platten benötigt wird, indem Sie (Gesamtzahl der Vertiefungen + 3) x 0,5 ml (8 Platten x 24 Vertiefungen = 192 + 3 = 195) x 0,5 ml = 97,5 ml multiplizieren.
3. 97,5 ml phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), die RHFF enthält, in einer Konzentration von 25 μg/ml herstellen, indem das Gesamtvolumen mit 25 μg multipliziert wird (97,5 x 25 = 2437,5 μg). Fügen Sie diese Menge RHFF zu 97,5 ml PBS hinzu.
4. Beschichten Sie nicht mit Gewebekulturen behandelte 24-Well-Platten mit 0,5 ml PBS/RHFF-Lösung pro Well.
5. Über Nacht bei 4 °C inkubieren.

Tag 2:

6. Entleeren Sie PBS/RHFF-Lösung von 24-Well-Platten, die nicht mit Gewebekulturen behandelt wurden.
7. 1 ml/Well 2 % Rinderserumalbumin (BSA) in PBS zugeben und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
8. Entfernen Sie BSA, indem Sie die Platte fest umdrehen. Waschen Sie mit 2 ml PBS.
9. Sammeln Sie den Virusüberstand, indem Sie Medien aus jeder mit 293T (HEK293T)-Poly-D-Lysin (PDL) beschichteten Platte der menschlichen embryonalen Niere in ein 250-ml-Zentrifugenröhrchen übertragen und 10 Minuten bei 500 x g drehen.
10. Den Virusüberstand vorsichtig in ein frisches 250-ml-Zentrifugenröhrchen umfüllen und dabei darauf achten, dass das möglicherweise gebildete Zellpellet nicht gestört wird.
11. Geben Sie frische TCM in den Virusüberstand, so dass das Endvolumen 3 ml mehr beträgt als die Menge, die für RHFF-beschichtete Vertiefungen benötigt wird. Bringen Sie beispielsweise für 192 RHFF-beschichtete Vertiefungen das Volumen des Virusüberstands auf 192 + 3 ml = 195 ml.
12. Nehmen Sie kultivierte Splenozyten aus dem Inkubator und resuspendieren Sie sie, indem Sie 2 - 3 Mal vorsichtig in jeder Vertiefung auf und ab pipettieren. In einen 250 ml Kegel geben. Wenn Sie eine Mehrkanalpipette verwenden, hilft die Verwendung eines sterilen Reservoirs vor dem Transfer, diesen Schritt zu beschleunigen. Zähle wie zuvor beschrieben und schleudere bei 300 x g für 10 min.
13. Geben Sie rekombinantes humanes Interleukin-2 (rhIL-2) in einer Konzentration von 50 I.E./ml zum Virusüberstand hinzu. Fügen Sie z. B. 50 x 195 = 9.750 IE rhIL-2 zu 195 ml Virusüberstand hinzu.
14. Resuspendierung von Splenozyten im Virusüberstand bei 1 x 10⁶ Zellen/ml
15. 1 ml/Well Splenozytensuspension auf RHFF-beschichtete 24-Well-Platten geben.
16. Schleudern Sie 90 min lang gemäß den folgenden Einstellungen: 770 x g, Beschleunigung = 4, Bremse/Verzögerung = 0, 32 °C.
17. Bereiten Sie eine TCM-Lösung mit 50 I.E./ml rhIL-2 vor. Bereiten Sie beispielsweise eine 200 TCM-Lösung vor, indem Sie 10.000 IE rhIL-2 hinzufügen. Geben Sie nach der Zentrifugation 1 ml rhIL-2/TCM in jede Vertiefung.
18. Über Nacht bei 37 °C in 5 % CO₂ anbauen.

>3. CAR-T-Zellkultur und -Ernte

Tag 3 und 4:

1. Wenn T-Zellen eine Konfluenz von >80 % erreichen, können die Zellen gespalten werden (dies geschieht normalerweise an Tag 3 oder Tag 4). Um die Zellen zu teilen, pipettieren Sie vorsichtig 2-3 Mal in jeder Vertiefung auf und ab und geben Sie 1 ml aus jeder Vertiefung in neue Vertiefungen einer frischen 24-Well-Platte mit Gewebekultur. Geben Sie dann 1 ml frisches TCM mit 50 IE/ml IL-2 in jede Vertiefung, so dass das endgültige Volumen in allen Vertiefungen 2 ml beträgt.
2. Wenn die Zellen eine Konfluenz von >80 % nicht erreichen, führen Sie einen halben Medienwechsel durch, indem Sie langsam 1 ml Medium von der Oberseite jeder Vertiefung abpipettieren. Vermeiden Sie störende Zellen, die sich beim Entfernen von Medien auf dem Boden absetzen. Fügen Sie 1 ml frisches TCM mit 50 I.E./ml rhIL-2 hinzu.

Tag 5:

3. Resuspendieren Sie CAR-T-Zellen, indem Sie vorsichtig 3 Mal in jeder Vertiefung auf und ab pipettieren und in ein 250-ml-Zentrifugenröhrchen umfüllen. Zellen bei 300 x g für 10 min schleudern.
4. Überstand vollständig absaugen, ohne die Pellets zu stören. Einmal mit PBS waschen, Zellen wie zuvor beschrieben zählen und ein zweites Mal mit PBS waschen. Eine typische Ausbeute an CAR-T-Zellen beträgt ca. 1 x 10⁶ Zellen pro Well (8 Platten x 24 Wells = 192 x 10⁶ CAR-T-Zellen).
5. Resuspendieren Sie Zellen in PBS in einer Konzentration von 5 x 10⁷/ml für eine Injektion von 1 x 10⁷ in einem Volumen von 200 μg (z. B. für 192 x 10⁶ CAR-T-Zellen resuspendieren Sie gewaschenes Pellet in 3,84 ml PBS).

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Concanavalin A	Sigma Aldrich	Um 2010	Unspezifisches Mitogen zur Induktion der T-Zellproliferation und der viralen Transduktion
RPMI 1640	Lebenstechnologien	Artikel-Nr.: 11875-093	T-Zell-Kulturmedien
Rinderserumalbumin (BSA), Fraktion V – Standardqualität	Gemini Bio Produkte	700-100P	Blockiert die unspezifische Bindung von Retroviren an Retronektin-beschichtete Platten
Pharm Lyse (10X Konzentrat)	BD Biowissenschaften	555899	Lysiert rote Blutkörperchen während der Splenozytenverarbeitung
70 μm sterile Zellsiebe	Corning	Artikel-Nr.: 352350	Filtert große Gewebepartikel während der Splenozytenverarbeitung
100 mm BioCoat Kulturschalen mit Poly-D-Lysin	Corning	356469	Fördert die Adhäsion von HEK293-Zellen, um die Proliferation nach der Transfektion zu maximieren
Dimethylsulfoxid	Sigma Lebenswissenschaften	Nr. D2650	Notwendig für die vollständige Auflösung von Temozolomid
salzhaltig	Hospira	IM 0132 (5/04)	Lösungsmittel für Temozolomid und Ketamin/Xylazin
Ketathesia HCl	Henry Schein Tiergesundheit	Artikel-Nr.: 11695-0701-1	Ketamin-Lösung
AnaSed	Lloyd Inc	N/A	Xylazin sterile Lösung 100 mg/ml

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