Alle Verfahren, die die Probenentnahme beinhalten, wurden in Übereinstimmung mit den IRB-Richtlinien des Instituts durchgeführt. Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom örtlichen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. Unspezifische Expansion von zytotoxischen Effektor-T-Lymphozyten
- Präparation und Bestrahlung der Feederzellen bei 35 Gy. Für die Stimulation von 2 x 105 - 4 x 105 Effektorzellen werden 10 x 106 mononukleäre Zellen (PBMCs) aus dem peripheren Blut und 1 x 106 B-lymphoblastoide Zelllinien (BLCLs) von drei verschiedenen, gesunden Spendern hergestellt.
- Resuspendieren Sie sowohl Feederzellen als auch Effektorzellen in 15 ml Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI), ergänzt mit 10 % hitzeinaktiviertem fötalem Kälberserum (FCS), 2 mM L-Glutamin, Penicillin (100 IE/ml) und Streptomycin (0,1 μg/ml) und 300 IE/ml rekombinantem Interleukin-2 (IL-2).
- Fügen Sie Phytohämagglutinin (PHA-L) in einer Endkonzentration von 1 μg/ml hinzu, mischen Sie vorsichtig und verteilen Sie 150 μl der Zellsuspension pro Vertiefung in 96-Well-Platten mit U-Boden.
- Inkubieren bei 37 °C und 5 % CO2 in befeuchteter Atmosphäre.
- Kontrollieren Sie die Platte täglich, bis sich in den Kulturvertiefungen große Zellklumpen bilden (~Tag 7).
- Die Zellen werden in einen Kulturkolben mit 1 x 106 Zellen/ml in frischem Kulturmedium überführt.
- Bestimmen Sie die Gesamtzellzahl durch Zählen (2x pro Woche) und halten Sie sie bei 1 x 106 Zellen/ml in frischem Kulturmedium.
Anmerkung: Effektor-Immunzellen sollten im Ruhezustand (in der Regel 3 Wochen nach dem initialen Amplifikationsstimulus) für die therapeutische Verabreichung bereit sein. Die Reinheit und die Reaktivität dieser Effektorzellen sollten vor einer In-vivo-Injektion (z. B. mit In-vitro-Assays) überprüft werden.
>2. Vorbereitung präoperativer Effektorzellen
- Nach Überprüfung der Effektorzellzahl werden die Effektorzellen in einem 50-ml-Röhrchen durch Zentrifugation (300 x g für 5 min) gesammelt.
Anmerkung: Um einen eventuellen Verlust auszugleichen, bereiten Sie einen Überschuss an Zellen vor (z. B. 50 x 106).
- Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 15 ml sterilem PBS und zentrifugieren Sie sie 5 Minuten lang bei 300 x g, um die Wäsche durchzuführen.
- Entfernen Sie vorsichtig und vollständig den Überstand und resuspendieren Sie dann das Zellpellet in 1 ml sterilem PBS.
- Übertragen Sie die resuspendierten Zellen in ein 1,5-ml-Mikroröhrchen zur Zentrifugation bei 300 x g für 5 Minuten.
- Entfernen Sie den Überstand vorsichtig und vollständig, indem Sie langsam pipettieren.
- Resuspendieren Sie das Zellpellet in 8 μl sterilem PBS pro Maus.
Anmerkung: Dies ist ein entscheidender Schritt.
- Messen Sie das Volumen der Zellsuspension mit einer Mikropipette. Falls erforderlich, steriles PBS (20 x 106 Zellen in 15 μl PBS pro Dosis) zugeben und vorsichtig mischen.
- Überprüfen Sie mit einer Mikropipette, dass das endgültige Volumen pro Maus zwischen 15 und 20 μl (unbedingt < 20 μl) liegt.
- Halten Sie die Zellen bis zur stereotaktischen Injektion auf Eis.
Anmerkung: Mehr als 3-Stunden-Zeitpunkte wurden nicht getestet.
>3. Stereotaktische Injektion
- Einrichtung der Ausrüstung
- Montieren und kalibrieren Sie einen stereotaktischen Rahmen für Kleintiere gemäß den Anweisungen des Herstellers, um die Genauigkeit der intrakraniellen Injektionen (z. B. Spritzengröße, gewünschtes Volumen und Injektionsrate) zu gewährleisten.
Anmerkung: Es wird eine langsame Infusionsrate empfohlen (d. h. 2 - 3 μl/min).
- Installieren Sie das Material unter einer mikrobiellen Sicherheitswerkbank (MSC), um die Sterilität der Instrumente zu erhalten und die Mäuse vor Infektionen zu schützen.
Anmerkung: "Isotherme Blöcke" in ein Wasserbad bei 37 °C legen. Dieses System begrenzt die Unterkühlung von Mäusen während der Operation. Heizkissen, die für die postoperative Pflege notwendig sind, müssen während der kontinuierlichen Temperaturüberwachung verwendet werden.
- Präoperative Vorbereitung der Tiere
- Betäuben Sie eine Maus mit einer intraperitonealen Injektion von Ketamin (10 mg/ml) und Xylazin (0,1 mg/ml) bei 10 μl/g Körpergewicht der Maus.
- Führen Sie einen Zehenquetschtest durch, um die vollständige Anästhesie und Analgesie des Tieres sicherzustellen.
Anmerkung: Jede Bewegung ist ein Hinweis auf eine nicht tiefe Analgesie, und wenn dies der Fall ist, sind einige Minuten mehr erforderlich, bevor die Operation wiederholt wird.
- Sobald die Maus richtig betäubt ist, entfernen Sie mit einer Schere das Fell von der Operationsstelle (zwischen den beiden Ohren bis zur Nase).
- Präoperative Zellvorbereitung
- Resuspendieren Sie die Zellen vor jeder Injektion vorsichtig (mehrmals), um ein Verklumpen der Zellen zu verhindern.
- Ziehen Sie das erforderliche Zellsuspensionsvolumen (15 - 20 μl) vorsichtig in die 22-G-Mikrospritze ein, um die Aspiration von Blasen zu vermeiden.
Anmerkung: Dieser Schritt des Beladens der Zellen in die Mikrospritze ist wichtig, um die Varianz der injizierten Volumina zu minimieren. Füllen Sie die Zellen für jede einzelne Injektion zwischen den Eingriffen neu, um eine Verklumpung der Zellen zu verhindern und eine gleichmäßige Anzahl von Effektorzellen in der Kohorte zu gewährleisten.
- Legen Sie dann die Spritze in die angepasste Spritzenpumpe.
- Verfahrenspflege
- Desinfizieren Sie die Operationsstelle mindestens 3x mit Tupfern, die in Povidon-Jod-5%iger Lösung getränkt sind.
- Geben Sie eine befeuchtende Augensalbe in die Augen der Maus, um ein Austrocknen der Hornhaut zu verhindern.
- Positionieren Sie die anästhesierte Maus auf dem stereotaktischen Rahmen, auf einem warmen isothermen Block, der mit einer sterilen Plastikfolie bedeckt ist, um die Temperatur der Maus während der Operation zu halten und die Sterblichkeit zu begrenzen.
Anmerkung: Die Nase und die Zähne der Maus sollten angemessen über dem Zahnsteg positioniert werden, um einen ausreichenden Atemfluss während des Eingriffs zu gewährleisten.
- Sobald die Maus über der Zahnstange positioniert ist, ziehen Sie die Ohrbügel fest unter den Ohren der Maus fest, um den Kopf ruhig zu stellen.
Anmerkung: Achten Sie darauf, das Trommelfell nicht zu beschädigen oder die Atmung zu beeinträchtigen.
- Machen Sie mit einer sterilen Schere einen 1 - 2 cm langen sagittalen Hautschnitt in der Mittellinie entlang des oberen Teils des Schädels von anterior nach posterior, um den Schädel freizulegen.
- Identifizieren Sie den Schnittpunkt der sagittalen und koronalen Nähte (Bregma), der als Orientierungspunkte für die stereotaktische Lokalisation vor der Injektion dient (siehe Abbildung 1).
- Platzieren Sie die Mikrospritze über diesem Punkt.
- Bewegen Sie die Mikrospritze 2 mm rechts seitlich und 0,5 mm vor dem Bregma.
- Bohren Sie mit einem Mikrobohrer ein kleines Loch in den Schädel mit einem sterilen Bohrer an vorgegebenen Koordinaten. Achten Sie darauf, oberflächlich zu bleiben, um traumatische Verletzungen des Gehirns zu vermeiden.
Anmerkung: In diesem Protokoll wurden Immunzellen in einen etablierten Tumor injiziert (eine Woche nach der Injektion der Tumorzelle). Die Haut sollte wieder geöffnet werden (Narbe) und die Injektion wird an den gleichen Koordinaten durchgeführt, die für die Implantation der Tumorzellen verwendet wurden (das Loch ist in der Regel noch bis zu 2 Wochen nach der Injektion vorhanden). Es wurden die Koordinaten für die Injektion von Tumor- und Effektorzellen in das Hirnparenchym ausgewählt.
- Injektion von Immuneffektorzellen
- Führen Sie die Mikrospritze vorsichtig in das Bohrloch ein und bewegen Sie sich langsam mit der Nadel 3 mm nach unten in die Dura und dann 0,5 mm zurück bis zu einer Endtiefe von 2,5 mm, bevor Sie die Effektorzellen injizieren.
- Führen Sie die Effektorzellinjektion mit 2 - 3 μL/min durch und überwachen Sie die Mäuse während der gesamten Injektionszeit.
- Sobald die Injektion abgeschlossen ist, ziehen Sie die Nadel nur 1 mm weit zurück und lassen Sie die Mikrospritze eine weitere Minute lang an Ort und Stelle, bevor Sie die Mikrospritze langsam vollständig zurückziehen, um ein Auslaufen von der Infusionsstelle zu verhindern.
Anmerkung: Reinigen Sie nach der Entnahme des Tieres aus dem stereotaktischen Gerät sofort das Injektionsgerät für bevorstehende Versuche.
- Postoperative Betreuung und Nachsorge von Mäusen
- Entfernen Sie das Tier aus dem stereotaktischen Rahmen und tragen Sie sofort Povidon-Jod-5%ige Lösung auf die Inzisionsstelle auf und verschließen Sie die Haut mit einer geeigneten chirurgischen Naht.
- Tragen Sie 2% Lidocain-Gel direkt auf die Wunde auf und verabreichen Sie 0,15 μg/g Buprenorphin durch eine subkutane Injektion zur postprozeduralen Analgesie.
- Setzen Sie die betäubte Maus wieder in ihren Käfig über einem Heizkissen, das auf 37 °C eingestellt ist, um eine angemessene Körpertemperatur der Maus aufrechtzuerhalten und eine Unterkühlung zu vermeiden.
Anmerkung: Eine separate Unterbringung ist nicht notwendig.
- Überwachen Sie die Maus, bis sie sich vollständig von der Narkose erholt hat, und bringen Sie sie in einen Wohnraum.
Anmerkung: Bis heute wird dieses Protokoll gut unterstützt, da nur wenige unvorhergesehene Komplikationen aufgetreten sind (< 5% der injizierten Mäuse).
- Überwachen Sie die Mäuse täglich und euthanasieren Sie sie, wenn nachlassende gesundheitliche Anzeichen beobachtet werden (z. B. gebeugte Haltung, eingeschränkte Mobilität, Erschöpfung oder erheblicher Gewichtsverlust [≥ 15 %]).
