Genetisch veränderte CAR-T-Zellen mit einem CRISPR-Cas9-System

Abstract

Quelle: Sterner, R. M. et al., Using CRISPR/Cas9 to knock out GM-CSF in CAR-T Cells.J. Vis. Exp. (2019)

Das Video beschreibt einen Prozess zur Herstellung genetisch veränderter CAR-T-Zellen durch das CRISPR-Cas9-System. Die Infektion von T-Zellen mit CRISPR- und CAR-Lentiviren führt zu Veränderungen des Zielgens und zur Synthese eines chimären Antigenrezeptors (CAR), was schließlich zur Bildung genetisch veränderter CAR-T-Zellen führt.

Protocol

>1. Herstellung von CART19-Zellen

1. T-Zell-Isolierung, Stimulation und Ex-vivo-Kultur
   1. Führen Sie alle Zellkulturarbeiten in einer Zellkulturhaube mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung durch. Entnahme von mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) aus anonymisierten normalen Spenderblutkegeln, die während der Apherese entnommen wurden, da diese bekanntermaßen eine brauchbare Quelle für PBMCs sind.
   2. Um PBMCs zu isolieren, fügen Sie 15 mL eines Dichtegradientenmediums zu einem 50 mL Dichtegradienten-Trennröhrchen hinzu. Verdünnen Sie das Spenderblut mit einem gleichen Volumen phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), die 2 % fötales Rinderserum (FBS) enthält, um Zelleinklemmungen zu vermeiden.
      1. Geben Sie das verdünnte Spenderblut aus dem Konus in das Trennröhrchen, wobei Sie darauf achten, die Grenzfläche zwischen dem Blut und dem Dichtegradientenmedium nicht zu stören. Zentrifugieren Sie bei 1.200 x g für 10 min bei RT.
      2. Den Überstand in einen neuen konischen 50-ml-Stoff umfüllen, mit PBS + 2 % FBS waschen, indem bis zu 40 mL aufgebracht werden, 8 min bei RT bei 300 x g zentrifugieren, Überstand aspirieren, in 40 mL Puffer resuspendieren und Zellen zählen.
   3. Isolierung von T-Zellen aus PBMCs über ein magnetisches Bead-Kit mit negativer Selektion unter Verwendung eines vollautomatischen Zellseparators gemäß dem Protokoll des Herstellers.
   4. Um die isolierten T-Zellen zu kultivieren, bereiten Sie T-Zellmedium (TCM) vor, das aus 10 % humanem AB-Serum (v/v), 1 % Penicillin-Streptomycin-Glutamin (v/v) und serumfreiem hämatopoetischem Zellmedium besteht. Sterilisieren Sie das Medium, indem Sie durch einen 0,45 μm sterilen Vakuumfilter und dann mit einem 0,22 μm sterilen Vakuumfilter filtrieren.
   5. Waschen Sie die CD3/CD28-Kügelchen am Tag 0 (dem Tag der T-Zell-Stimulation) vor der Stimulation der T-Zellen. Zum Waschen das erforderliche Volumen an Kügelchen platzieren (verwenden Sie genügend CD3/CD28-Kügelchen für ein Verhältnis von 3:1 Kügelchen:T-Zellen; Beachten Sie, dass die Konzentration der Kügelchen variabel sein kann) in einem sterilen 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen und resuspendieren Sie es in 1 mL TCM.
   6. Mit einem Magneten in Kontakt bringen.
   7. Nach 1 Minute aspirieren Sie das TCM und resuspendieren es in 1 ml frischem TCM, um die Kügelchen zu waschen.
   8. Wiederholen Sie diesen Vorgang für insgesamt drei Wäschen.
   9. Nach der dritten Wäsche resuspendieren Sie die Kügelchen in 1 ml TCM.
   10. Zählen Sie die T-Zellen.
   11. Übertragen Sie die Kügelchen in einem Verhältnis von 3:1 Kügelchen zu Zellen auf die T-Zellen.
   12. Verdünnen Sie die Zellen auf eine Endkonzentration von 1 x 10⁶ Zellen/ml.
   13. Bei 37 °C, 5 % CO₂ 24 h inkubieren.
2. T-Zell-Transfektion und -Transduktion
   1. Führen Sie lentivirale Arbeiten mit BSL-2+-Vorsichtsmaßnahmen durch, einschließlich Zellkulturhauben, persönlicher Schutzausrüstung und Desinfektion gebrauchter Materialien mit Bleichmittel vor der Entsorgung.
   2. Erwerben Sie ein chimäres Antigenrezeptor-T19 (CART19)-Konstrukt in einem lentiviralen Vektor.
      Anmerkung: Das hier verwendete CART19-Konstrukt wurde unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Proteinsyntheseanbieters entworfen und dann de novo synthetisiert. Das CAR-Konstrukt wurde anschließend unter Kontrolle eines EF-1α-Promotors in ein Lentivirus der dritten Generation kloniert. Das Fragment der einkettigen variablen Region stammt aus dem FMC63-Klon und erkennt humanes CD19. Das CAR19-Konstrukt besitzt eine costimulatorische 4-1BB-Domäne der zweiten Generation und eine CD3ζ-Stimulation (FMC63-41BBz).
   3. Führen Sie die lentivirale Produktion wie zuvor beschrieben durch.
      1. Kurz gesagt, um Lentiviren herzustellen, verwenden Sie 293T-Zellen, die eine Konfluenz von 70-90% erreicht haben.
      Lassen
      2. Sie die Transfektionsreagenzien 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren, einschließlich 15 μg des interessierenden lentiviralen Plasmids, 18 μg eines gag/pol/tat/rev-Verpackungsvektors, 7 μg eines VSV-G-Hüllvektors, 111 μl des Präkomplexierungsreagenzes, 129 μl des Transfektionsreagenzes und 9,0 ml des Transfektionsmediums, bevor Sie zu den 293T-Zellen hinzugefügt werden. Anschließend werden die transfizierten Zellen bei 37 °C, 5 % CO_{2 kultiviert}.
      3. Ernte, Zentrifuge (900 x g für 10 min), Filter (0,45 μM Nylonfilter) und Konzentratüberstand bei 24 und 48 h durch Ultrazentrifugation bei entweder 13.028 x g für 18 h oder 112.700 x g für 2 h.
      4. Für die zukünftige Verwendung bei -80 °C einfrieren.
   4. An Tag 1 resuspendieren Sie die T-Zellen vorsichtig, um die Rosetten der T-Zellen aufzubrechen, die an Tag 0 bei 1 x 10⁶/ml stimuliert wurden.
   5. Unter geeigneten BSL-2+-Vorsichtsmaßnahmen für alle lentiviralen Arbeiten ist frisches oder gefrorenes geerntetes Virus zu den stimulierten T-Zellen bei einer Infektionsmultiplizität (MOI) von 3,0 hinzuzufügen.
3. CAR-T-Zell-Erweiterung
   1. Während der Expansionsphase werden die transduzierten T-Zellen bei 37 °C, 5 % CO₂ weiter inkubiert. Zählen Sie CAR-T-Zellen an den Tagen 3 und 5 und fügen Sie frische, vorgewärmte TCM zur Kultur hinzu, um eine CAR-T-Zellkonzentration von 1 x 10⁶/ml aufrechtzuerhalten.
   2. Entfernen Sie die Kügelchen von den transduzierten T-Zellen 6 Tage nach der Stimulation (Tag 6) mit einem Magneten. Ernten, resuspendieren und T-Zellen in konischen 50-ml-Röhrchen in einem Magneten für 1 Minute platzieren. Sammeln Sie dann den Überstand (enthält die CAR-T-Zellen) und entsorgen Sie die Kügelchen.
   3. Legen Sie die gesammelten CAR-T-Zellen in einer Konzentration von 1 x 10⁶ Zellen/ml wieder in Kultur, um die Expansion fortzusetzen.
   4. An Tag 6 ist die Oberflächenexpression des CAR durch Durchflusszytometrie zu beurteilen.
      Anmerkung: Um die Oberflächenexpression von CAR nachzuweisen, können verschiedene Methoden verwendet werden, wie z. B. die Färbung mit einem kreuzadsorbierten Sekundärantikörper mit Ziegen-Anti-Maus-IgG (H+L) oder die Färbung mit einem CD19-spezifischen Peptid, das an ein Fluorochrom konjugiert ist. Hier wird ein Aliquot (ca. 100.000 T-Zellen) aus der Kultur entnommen und mit einem Fließpuffer gewaschen, der mit Dulbeccos phosphatgepufferter Kochsalzlösung, 2 % fötalem Rinderserum und 1 % Natriumazid hergestellt wurde. Färben Sie die Zellen mit dem Anti-CAR-Antikörper und waschen Sie sie zweimal. Färben Sie die Zellen mit Lebend-/Totfärbung und monoklonalem CD3-Antikörper (OKT3). Waschen Sie die Zellen und resuspendieren Sie sie in einem Flusspuffer. Auf einem Zytometer erfassen, um die Transduktionseffizienz zu bestimmen.
4. CAR-T-Zell-Kryokonservierung
   1. Um CAR-T-Zellen 8 Tage nach der Stimulation (Tag 8 der T-Zell-Expansion) zu ernten und zu kryokonservieren, ernten Sie die Zellen aus Kultur.
   2. 5 min bei 300 x g runterdrehen.
   3. Resuspendieren Sie in Gefriermedium mit 10 Millionen Zellen pro ml pro Durchstechflasche in Gefriermedium, das aus 10 % Dimethylsulfoxid und 90 % fötalem Rinderserum besteht.
   4. In einem Gefrierbehälter einfrieren, um eine Abkühlgeschwindigkeit von -1 °C/min in einem -80 °C-Gefrierschrank zu erreichen, und dann nach 48 h in flüssigen Stickstoff überführen.
   5. Vor ihrer Verwendung für in vitro oder in vivo Experimente werden CAR-T-Zellen in warmer TCM aufgetaut.
   6. Waschen Sie die Zellen, um das Dimethylsulfoxid zu verdünnen und zu entfernen, und resuspendieren Sie es auf eine Konzentration von 2 x 10⁶ Zellen/ml in warmer TCM. Über Nacht bei 37 °C, 5 % CO₂ ruhen.

>2. Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor (GM-CSF ^k/o) CART19-Produktion

1. Um GM-CSF zu stören, verwenden Sie eine Guide-RNA (gRNA), die auf das Exon 3 von humanem GM-CSF (CSF2) abzielt und über Screening-gRNAs ausgewählt wurde, von denen zuvor berichtet wurde, dass sie eine hohe Effizienz für das CSF2-Gen aufweisen, das für das humane Zytokin GM-CSF kodiert
   Anmerkung: Es wurde ein kommerziell synthetisiertes Cas9-Konstrukt der dritten Generation in Forschungsqualität verwendet, das diese gRNA (unter einem U6-Promotor) enthält. Das Konstrukt enthält ein Puromycin-Resistenzgen. Die Sequenz der gRNA ist GACCTGCCTACAGACCCGCC.
2. Um Lentiviren zu produzieren, verwenden Sie 293T-Zellen, die eine Konfluenz von 70-90% erreicht haben.
3. Lassen Sie 15 μg des interessierenden lentiviralen Plasmids, 18 μg eines gag/pol/tat/rev-Verpackungsvektors, 7 μg eines VSV-G-Hüllvektors, 111 μl des Präkomplexierungsreagenzes, 129 μl des Transfektionsreagenzes und 9,0 ml des Transfektionsmediums 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren.
4. Geben Sie Transfektionsreagenzien zu den 293T-Zellen. Die Kultur bei 37 °C, 5 % Kohlendioxid (CO₂).
5. Ernten, zentrifugieren (900 x g für 10 min), filtrieren (0,45 μM Nylonfilter) und den Überstand des Konzentrats bei 24 und 48 h durch Ultrazentrifugation entweder bei 13.028 x g für 18 h oder 112.700 x g für 2 h und für die zukünftige Verwendung bei -80 °C einfrieren.
6. An Tag 1 resuspendieren Sie die T-Zellen vorsichtig, um Rosetten aufzubrechen.
7. Fügen Sie in einem BSL-2+-zugelassenen Labor ein gefrorenes oder frisch geerntetes Virus zu den stimulierten T-Zellen hinzu, um CAR-T-Zellen zu erzeugen. Transduzieren Sie T-Zellen sowohl mit dem CAR19-Lentivirus als auch mit GM-CSF, die auf das CRISPR-Lentivirus abzielen. Fügen Sie CAR19-Lentivirus mit einem MOI von 3 hinzu. Da eine Titration des CRISPR-Lentivirus nicht möglich war, verwenden Sie Viruspartikel, die aus einem 15 μg Plasmidpräparat erzeugt wurden, um 10 x 10⁶ T-Zellen zu transduzieren.
8. Sehen Sie sich die verbleibenden Schritte der T-Zell-Stimulation, -Expansion und -Kryokonservierung an, wie in Schritt 1 beschrieben.
9. Bei LentiCRISPR-editierten T-Zellen mit Puromycin-Resistenz sind an Tag 3 und Tag 5 Zellen mit Puromycindihydrochlorid in einer Konzentration von 1 μg Puromycin pro 1 ml zu behandeln.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
CD3 Monoklonaler Antikörper (OKT3), PE, eBioscience	Invitrogen	Artikel-Nr.: 12-0037-42
CD3 monoklonaler Antikörper (UCHT1), APC, eBioscience	Invitrogen	Artikel-Nr.: 17-0038-42
Wahl Taq Blue Mastermix	Denville Scientific	C775Y51
CTS (Zelltherapiesysteme) Dynabeads CD3/CD28	Gibco	40203D
CytoFLEX System B4-R2-V2	Beckman Coulter	Nr. C10343	Durchflusszytometer
Dimethylsulfoxid	Millipore Sigma	D2650-100ML
Dulbecco's Phosphatgepufferte Kochsalzlösung	Gibco	Nr. 14190-144
Dynabeads MPC-S (Magnetpulver-Konzentrator)	Angewandte Biosysteme	Nr. A13346
Easy 50 EasySep Magnet	STEMCELL-Technologien	Nr. 18002
EasySep Isolationskit für humane T-Zellen	STEMCELL-Technologien	Nr.: 17951	Magnetische Perlen mit negativer Selektion; 17951RF enthält Spitzen und Puffer
Fötales Rinderserum	Millipore Sigma	Nr. F8067
FITC Maus Anti-Human CD107a	BD Pharmingen	Artikel-Nr.: 555800
Fixiermittel (Medium A)	Invitrogen	GAS001S100
GenCRISPR gRNA Konstrukt: Name: CSF2	GenScript	N/A	Sonderanfertigung
CRISPR-Leit-RNA 1; Spezies: Mensch, Vektor:
pLentiCRISPR v2; Resistenz: Ampicillin; Exemplar-Nummer:
Hoch; Plasmidvorbereitung: Standardlieferung: 4 μg (Kostenlos
gegen Gebühr)
Ziegen-Anti-Maus-IgG (H+L) kreuzadsorbierter Sekundärantikörper, Alexa Fluor 647	Invitrogen	Nr. A-21235
https://tide.nki.nl.	Desktop-Genetik
AB-Serum für den Menschen; männliche Spender; Typ AB; Uns	Corning	35-060-CI
IFN gamma Monoklonaler Antikörper (4S. B3), APC-eFluor 780, eBioscience	Invitrogen	Tel.: 47-7319-42
Lipofectamine 3000 Transfektionsreagenz	Invitrogen	L3000075
LIVE/DEAD Fixierbares Aqua Dead Cell Stain Kit, für 405 nm Anregung	Invitrogen	Nr. L34966
Lymphoprep	STEMCELL-Technologien	7851
Monensin-Lösung, 1000X	BioLegende	420701
Maus Anti-Mensch CD28 Klon CD28.2	BD Pharmingen	Artikel-Nr.: 559770
Maus Anti-Mensch CD49d Klon 9F10	BD Pharmingen	561892
Maus Anti-Human MIP-1β PE-Cy7	BD Pharmingen	560687
Mr. Frosty Gefrierbehälter	Thermo Scientific	Artikel-Nr.: 5100-0001
NALM6, Klon G5	ATCC	CRL-3273	Zelllinie der akuten lymphatischen Leukämie
Nukleasefreies Wasser	Promega	Nr. 119C
Olympus Vakuumfiltersysteme, 500 mL, PES-Membran, 0,22 μM, steril	Genesee Scientific	Nr. 25-227
Olympus Vakuumfiltersysteme, 500 mL, PES-Membran, 0,45 μM, steril	Genesee Scientific	Nr. 25-228
Opti-MEM I Reduziertes Serummedium (1X), flüssig	Gibco	Artikel-Nr.: 31985-070
PE-CF594 Maus Anti-Human IL-2	BD Horizont	562384
Penicillin-Streptomycin-Glutamin (100X), flüssig	Gibco	Tel.: 10378-016
Permeabilisierungsmedium (Medium B)	Invitrogen	GAS002S100
PureLink Genomic DNA Mini Kit	Invitrogen	K182001
Puromycin-Dihydrochlorid	MP Biomedicals, Inc.	210055210
QIAquick Gel-Extraktionskit	QIAGEN	Artikel-Nr.: 28704
Ratte Anti-Mensch GM-CSF BV421	BD Horizont	Artikel-Nr.: 562930
RoboSep-S	STEMCELL-Technologien	21000	Vollautomatischer Zellseparator
SepMate-50 (IVD)	STEMCELL-Technologien	Artikel-Nr.: 85450
Natriumazid, 5% (w/v)	Ricca Chemical	7144.8-16
X-VIVO 15 Serumfreies hämatopoetisches Zellmedium	Lonza	04-418Q