Eine CRISPR-Cas9-Technik zur Gen-Editierung in T-Zellen

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Quelle: Agarwal, S., et al. Produktion von humanen CRISPR-modifizierten CAR-T-Zellen. J. Vis. Exp. (2021).

Dieses Video zeigt einen Assay zur Durchführung von Gen-Editierung in menschlichen T-Zellen mit der CRISPR-Cas9-Technologie. Eine Mischung aus primären CD4+- und CD8+-T-Zellen wird mit einem CRISPR-Cas9-Ribonukleoprotein-Komplex kombiniert, der auf spezifische Gene für den Knockout abzielt. Bei der Elektroporation leitet die sgRNA Cas9 zur Ziel-DNA-Sequenz und erzeugt so präzise Schnitte. Diese Schnitte werden dann durch den nicht-homologen Endverbindungsmechanismus der Zelle repariert, was zu einem Gen-Knockout führt.

Protokoll

Alle Verfahren, die die Probenentnahme beinhalten, wurden in Übereinstimmung mit den IRB-Richtlinien des Instituts durchgeführt.

>1. Design von sgRNAs und Gendisruption in primären menschlichen T-Zellen

Design von CRISPR-sgRNAs
Anmerkung: Mehrere Server und Programme erleichtern das Design von zielspezifischen Single Guide RNAs (sgRNA). In diesem Protokoll wurden geclusterte CRISPR-sgRNAs (Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) mit Hilfe von CHOPCHOP (https://chopchop.cbu.uib.no) und dem gRNA-Designportal des Broad Institute (https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design) entworfen.
1. Entwerfen Sie für jedes Zielgen sechs bis zehn sgRNA-Sequenzen, die auf früh kodierende Exon-Sequenzen abzielen.
  HINWEIS: sgRNA sollte eine hohe On-Target-Wirksamkeit und eine geringe Off-Target-Wirksamkeit aufweisen. Jeder Machine-Learning-Algorithmus zur Bestimmung der sgRNA-Wirksamkeit funktioniert etwas anders. Daher wird empfohlen, mehrere sgRNA-Design-Tools zu vergleichen und eine Liste von sechs bis zehn sgRNA für das Screening zu erstellen.
Gendisruption in primären humanen T-Zellen
1. Gewinnen Sie autologe mononukleäre Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) von gesunden freiwilligen Spendern. Eine schematische Zeitleiste des Protokolls ist in Abbildung 1A beschrieben und im Folgenden beschrieben.
2. Isolieren Sie CD4+- und CD8+-T-Zellen mit kommerziell erhältlichen CD4- und CD8-Selektionskits.
3. Kombinieren Sie CD4+- und CD8+-T-Zellen im Verhältnis 1:1 und inkubieren Sie über Nacht bei 3x10⁶ Zellen/ml in R10, ergänzt mit jeweils 5 ng/ml humanem Interleukin-7 (huIL-7) und humanem Interleukin-15 (huIL-15). Die Zugabe von IL-7 und IL-15 wird empfohlen, da bekannt ist, dass sie einen Phänotyp des zentralen Gedächtnisses fördern und chimäre Antigenrezeptor (CAR)-T-Zellen, die mit IL-7 und IL-15 expandiert sind, im Vergleich zu Interleukin-2 (IL-2) expandierten CAR-T-Zellen eine überlegene Anti-Tumor-Wirksamkeit aufweisen.
4. Am nächsten Tag T-Zellen zählen und 5-10 x 10⁶ Zellen bei 300 x g für 5 Minuten zentrifugieren. Entsorgen Sie den gesamten Überstand und waschen Sie das Zellpellet in einem minimal essentiellen Medium mit reduziertem Serum. Das Pellet wird in 100 μl Nukleofektionslösung gemäß den Anweisungen des Herstellers resuspendiert (Materialtabelle).
5. Während des Waschens der Zellen wird der Ribonukleoprotein (RNP)-Komplex mit dem CRISPR-assoziierten Protein 9 (Cas9) und gRNA hergestellt, indem 10 μg Cas9-Nuklease mit 5 μg sgRNA für 10 min bei Raumtemperatur (RT) inkubiert werden. Das molare Verhältnis von Cas9 zu sgRNA beträgt 1:2,4. Eine Scheinkontrolle, die Cas9 und einen Elektroporationsverstärker, aber keine sgRNA enthält, wird empfohlen.
  Anmerkung: Die Multiplex-Gen-Editierung kann in diesem Schritt durchgeführt werden, indem RNP-Komplexe für jedes Ziel separat hergestellt und zum Zeitpunkt der Nukleofektion mit Zellen kombiniert werden, wie im nächsten Schritt beschrieben. Die Auswahl der Reagenzien für den Aufbau des RNP-Komplexes ist der Schlüssel zu einer hohen Knockout-Effizienz (KO). Zum Beispiel haben Cas9-Nukleasen von verschiedenen Anbietern unterschiedliche Off-Target-Effekte, und chemisch modifizierte gRNA verringert die Toxizität für T-Zellen und erhöht dadurch die KO-Effizienz.
6. Kombinieren Sie die resuspendierten Zellen aus Schritt 1.2.4 mit dem RNP-Komplex aus Schritt 1.2.5 und fügen Sie 4,2 μl 4 μM Elektroporationsverstärker hinzu (einzelsträngiges DNA-Oligonukleotid [ssDNA], das nicht homolog zum menschlichen Genom ist). Gut mischen und in Elektroporationsküvetten umfüllen. Vermeiden Sie Blasen, da sie die Effizienz der Elektroporation beeinträchtigen.
7. Elektroporatzellen mit dem Impulscode EH111. Nach der Elektroporation inkubieren Sie Zellen in R10, ergänzt mit 5 ng/ml, huIL-7 und huIL-15 bei 5x10,⁶ Zellen/ml bei 30 °C für 48 h in 12-Well-Platten. Fahren Sie nach 48 Stunden mit der Aktivierung und Expansion der T-Zellen fort.

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Ergebnisse

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Abbildung 1. Expansion von editierten CAR-T-Zellen und deren Populationsverdoppelung. (A) Zeitleiste der CRISPR-Editierung und -Herstellung in primären menschlichen CART-Zellen. (B) Populationsverdopplungen in Mock- und CRISPR-editierten CD19-CAR-T-Zellen, gemessen mit einem Scharzähler während der Expansion der CAR-T-Zellen (n=3 gesunde Spender; ...